[发明专利]东北林蛙及其卵油的分子鉴别方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种生物的分子鉴别方法，主要针对东北林蛙动物种及其产品卵油的分子鉴别方法。

背景技术：

东北林蛙具有重要经济意义和医疗保健价值。雌蛙输卵管干制品入药，称为林蛙油或哈士蟆油，为名贵的动物药材。该药材鉴定目前仍主要依据性状特点、显微特征、理化性质等，但由于该药材缺乏明显的形态鉴别特征和特殊的化学成分，实践中对林蛙卵油的鉴定仍感到十分困难。

发明内容：

针对东北林蛙和林蛙卵油在生产经营实践中难以从性状特点、显微特征、理化性质等方面进行鉴定的问题，本发明应用分子生物学技术解决林蛙卵油及其药源动物东北林蛙的分子鉴定，提供了一种以PCR技术为基础，筛选特异引物进行扩增，从而达到对东北林蛙及其卵油的分子鉴别方法，具体实现步骤为：

(1)基因组DNA提取：

①称取组织样品100～500mg，剪碎，放入灭菌的1.5ml的EP管中；

②加入600μl 1×SET液、20μl蛋白酶K(10mg/ml)、25μl SDS，温度在55℃的条件下，空气浴2小时；

③加500μl Tris饱和酚和200μl TE上下颠倒10分钟；

④以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；

⑤加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(24:23:1)，再补加200μl TE混合10分钟；

⑥以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；

⑦加入等体积的氯仿:异戊醇(23:1)，再补加200μl TE混合10分钟；

⑧以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；

⑨加入2倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，水平摇动30次，用枪头挑出白色DNA沉淀；

⑩加入700μl 70％的冷乙醇，以8000转/分钟，离心5分钟，倒掉乙醇，自然干燥；

加入TE溶液50～100μl，置于55℃水浴3～4小时；

在4℃下保存。

(2)基因组DNA检测与浓度测定

用紫外分光光度计测定DNA浓度：根据记录的OD260/280比值，估测DNA质量，OD260/280在1.6～1.8之间，可以满足试验要求；根据记录的OD260数值及测试液稀释倍数，换算出DNA的浓度。对DNA原液作相应的稀释，以50ng/μl分装，作为工作液4℃保存使用。

(3)PCR扩增

采用特异引物(F：5′-GCC TTT CTA CCG CAA ATA-3′；R：5′-AGG TGCTTT TTT TCT GGG-3′)于PCR仪中进行扩增。

(4)特异扩增产物鉴别

扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，100V恒压，EB染色；在凝胶图谱分析系统上观察和分析，并记录结果；东北林蛙及卵油基因组DNA在1000bp处扩增出特异条带，无性别和个体差异，作为东北林蛙及卵油鉴别的特征谱带。

本发明的特点及有益效果：

本发明从分子生物学基本理论出发，应用现代分子标记技术对东北林蛙和卵油进行分子鉴别，具有理论基础科学可信，技术手段和实现步骤先进合理，以及检测结果可靠等特点。本发明中，PCR扩增引物的筛选和琼脂糖凝胶电泳特征谱带的检测是中心环节，多次反复检测试验证明，所筛选引物特异性强，琼脂糖凝胶电泳特征谱带(1000bp)稳定性高，在实际应用中能够获得可靠而有益的效果。

附图说明：

图1林蛙样本特异引物DNA扩增图谱

具体实施方式：

东北林蛙及其卵油的分子鉴别方法，该方法是一种以PCR技术为基础，筛选特异引物进行扩增，实现对东北林蛙和卵油的分子鉴别，具体实现步骤为：

(1)基因组DNA提取：

①称取组织样品100～500mg，剪碎，放入灭菌的1.5ml的EP管中；

②加入600μl 1×SET液、20μl蛋白酶K(10mg/ml)、25μl SDS，温度在55℃的条件下，空气浴2小时；

③加入500μl Tris饱和酚和200μl TE上下颠倒10分钟；

④以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；

⑤加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(24:23:1)，再补加200μl TE混合10分钟；

⑥以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；

⑦加入等体积的氯仿:异戊醇(23:1)，再补加200μl TE混合10分钟；