[发明专利]一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法

说明书

技术领域

本发明涉及发酵技术领域，具体涉及一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法。

背景技术

人参皂苷Rd对心血管，免疫系统，神经系统等具有良好的药理作用，有些药理作用是人参皂苷Rd独有而其他的单体皂苷没有的生物活性。

人参皂苷Rd在人参中含量较低，只有0.2％左右，因其结构复杂，化学合成至今尚未成功，目前从人参、三七等植物根、茎、叶中提取来获得Rd单体，提取方法由于其收率低，成本较高，影响了医疗保健市场需求的进一步扩大，因此有必要开发一种产率高，纯度好，并且简单易行的制取人参皂苷Rd的方法。

对比相对含量较高的人参皂苷Rb1，Rb2，Rc等主要皂苷，人参皂苷Rd的差别在于20位糖链末端的糖苷键(图1)。理论上可以通过这些糖基的水解得到人参皂苷Rd。目前有研究试图利用加热、酸水解法、碱水解法等化学方法将主要皂苷转化为活性更高的稀有皂苷。但是这些化学水解条件都十分剧烈，不易控制，而且在水解过程中能使皂苷元发生脱水、环合、差向异构、羟化等反应，产生较多副产物，很难得到目标产物。生物转化的区域和立体选择性强、反应条件温和，这就使得酶转化法和微生物转化法制备稀有人参皂苷受到青睐。

从动物代谢来看，人参皂苷Rd可以由主要皂苷Rb1代谢而来，与其它皂苷不同的是，在胃中并不能由人参皂苷Rb1水解得到人参皂苷Rd，也不能由肠道菌分解得到人参皂苷Rd，人参皂苷Rd主要通过肠道酶水解得到。目前只有利用微生物来源的酶转化得到人参皂苷Rd的研究报道，这些研究中转化过程中存在转化产物不专一以及人参皂苷对酶的明显抑制，而且转化底物采用的都是高纯度的Rb1，导致这些转化方法酶用量大，在加上底物成本高，对工业化生产造成极大限制。

由于酶转化法应用困难，使得微生物转化法制备Rd单体更有研究价值和应用前景，但是迄今为止还没有利用微生物发酵专一性制备人参皂苷Rd的报道。

发明内容

本发明提供一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法，包含下列步骤：

a)人参皂苷加入培养液中，接种拟青霉菌(Paecilomyces sp)进行发酵反应；

b)收获菌体，菌体加入醇液提取，获得醇提取液；

c)饱和正丁醇萃取醇提取液；

d)层析柱分离、纯化。

在一优选实施例中，所述拟青霉菌为人参皂苷耐受性高的拟青霉菌Paecilomyces sp.4685，能进行微生物转化反应，并使主要产物停留在Rd。本发明所述的拟青霉菌Paecilomyces sp.4685可以从中国工业微生物菌种保藏管理中心获得。

在优选实施例中，所述人参皂苷来源于人参、红参、白参、尾参、人参叶或人参花蕾以及同属的植物根、茎、叶。

在优选实施例中，所述人参皂苷的投料量为培养液重量的0.5-7％，其中优选1％-2％。

在优选实施例中，所述醇液选自甲醇或乙醇。

在优选实施例中，所述培养液中碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、马铃薯或淀粉中之一或任何组合，其中优选淀粉。

在优选实施例中，所述培养液中迟效氮源选自玉米浆，棉籽粉，酵母粉，黄豆粉，蛋白胨，花生粉中之一或任何组合，其中优选棉籽粉。

在优选实施例中，所述培养液中速效氮源选自尿素，硝酸钠，氯化铵，硫酸铵，硝酸钾，醋酸铵中之一或任何组合，其中优选硝酸钠。

在优选实施例中，所述培养液包含淀粉2-4％，棉籽粉2-4％，硝酸钠0.05-0.2％，硫酸镁0.05-0.2％，氯化钙0.05-0.2％，麸皮0.1-1％。

在优选实施例中，所述培养液的pH值为pH4-8，其中优选pH 5。

在优选实施例中，所述层析柱的填料为大孔吸附树脂。

本发明所公开的方法转化率高，其转化率能保持在70-90％，发酵产物人参皂苷Rd的纯度为98％，能够实现人参皂苷Rd的微生物产业化制备，扩充人参皂苷Rd药物资源来源，满足广阔的医疗保健的市场需要都有极大价值。

附图说明

图1.人参皂苷Rd的转化途径示意图。

图2.碳源对转化效果的影响。

图3.迟效氮源对转化效果的影响。

图4.底物投料量对转化效果的影响。

图5.转化时间对转化效果的影响。

图6.pH值对转化效果的影响。

图7.底物和产物的HPLC检测图。

具体实施方式