[发明专利]大规模并列核酸分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及使用预先固定于固相载体上的引物，将核酸混合物中所含的各个核酸试样分别各自进行并列扩增并进行分析的方法。本发明还涉及分别并列扩增和分析所必需的试剂盒和装置。

背景技术

在核酸序列测定、基因診断或基因表达的解析、突变的解析时，为了确保其检测精度，有必要预先将成为解析对象的核酸扩增至分析所需的充分的量。也有由于将核酸扩增而无法正确地反映原始的核酸序列或量比、从而分析结果存在问题的意见，而不进行扩增即可直接检测一个分子的技术(单分子测定)的开发也正在大力进行。但是，达到现实上可实用化而必须要超越的阻碍还很多，从而目前在核酸解析工序中必须进行将解析对象核酸进行扩增的工序。

另一方面，解析对象核酸大多数情况下是将具有不同种类序列的核酸以混合物的状态提供的。无论是将混合物中的全部核酸作为解析对象，还是仅以特定的核酸为对象，均需要分别扩增混合物中所含的核酸。

作为扩增核酸的技术，大致有2种。一种为使用大肠杆菌等使其进行生物扩增的克隆技术。另一种为使用酶通过化学反应在体外进行扩增的技术(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Third Edition)，Cold SpringHarbor Laboratory Press)。

克隆法中，一般是首先将核酸片段插入到载体中，接着将含有所关注的片段的载体导入大肠杆菌等宿主中。通常，宿主在增殖培养基(例如琼脂板)上形成菌落。各菌落起源于各个宿主，分别由以数百万级扩增了的宿主所形成。将各菌落分别移至容器中，在液体培养基内进一步复制宿主细胞，从而可以分别地进一步扩增。从该扩增了的宿主细胞中回收靶核酸，并进行分析。该方法即便当初核酸为多种的混合物，也可以在形成菌落的阶段进行分离、接着通过在液体培养基中的复制，可以分别扩增。另一方面，宿主细胞的生物扩增速度成为整个工序的控速因素，需要很长的操作时间。而且，复杂的操作工序也存在不适于自动化和大规模化的问题。

另一方面，在使用酶的扩增法中，作为代表性技术，可以举出PCR(聚合酶链反应)法。该方法中，预先准备具有与所关注核酸区域的两末端序列互补的序列的短核酸(引物)。使用耐热性DNA聚合酶使引物延伸后，在高温条件下使核酸变性，接着降低温度，预先过量投入后剩余的引物再次与靶核酸进行互补链结合，引起延伸反应。是将该引物的延伸产物作为扩增产物的方法。反复进行温度的升降，从而最终可以获得2ⁿ(n表示温度升降的次数)的核酸。另外，还有利用噬菌体来源的具有链置换能力的DNA聚合酶，将成为模板的环状DNA互补链进行连续合成以进行扩增的滚环扩增(Rolling Circle Amplification)法等。该方法也能够将环状DNA扩增至指数常数的最大10⁹拷贝。任一方法中，均可以在管内短时间内获得大量的核酸。而且，这些方法由于操作工序简单，因此也适于自动化。另一方面，与克隆法不同，不适于多种核酸试样混合物的分别扩增。即，虽然可以同时扩增，但无法分离不同种类核酸。一般来说，通过PCR法从混合物中分离靶核酸时，考虑了使引物序列特异于各个核酸、在扩增后通过电泳等分离产物等方法，但由于各操作均非常复杂，因此不适于大量样品的解析。另外，使引物序列具有特异性是仅对应已知序列的方法，还具有无法用于具有未知序列的解析对象的问题。