[发明专利]一种改进的拮抗细菌生物测定方法

说明书

技术领域

本发明技术领域属于农学门类，植物保护一级学科下设的植物病理学二级学科，更具体涉及一种生物农药研制和开发中所必须的拮抗细菌生物活性测定方法。

背景技术

1、生物防治在可持续农业的发展中发挥着越来越重要的作用。生物防治的一个重要内容就是利用微生物防治病害，有益微生物中用于研究防治植物真菌病害较多的是细菌，如芽孢杆菌属(Bacillus sp)和假单孢杆菌属(Pseudomonas sp)的一些种，人们通常称之为拮抗细菌或生防细菌，众多研究证明一些细菌对植物病原真菌生长具有较强的抑制作用，与病菌对峙培养，能表现出明显的抑菌带，其代谢物质能引起病菌菌丝消解和细胞内溶，能抑制病菌菌丝生长和孢子萌发，在病害防治中显示出较好的生防效果。

2、在拮抗细菌的筛选过程中，拮抗细菌对病原菌的生物测定方法具有至关重要的作用，它是生物农药研制和开发必不可少的一个重要环节。目前采用的生物测定方法通常有拮抗菌与病菌之间平板对峙培养法；菌体直接作用测定法、三明治法；拮抗细菌无菌发酵液(细菌过滤器过滤、高温灭菌)抗菌能力测定法，其中又包括发酵液混于培养基中抑制病菌菌落生长测定法、发酵液抑制孢子萌发测定法、发酵液管碟法、发酵液滤纸片法等。我们经过多年的实验研究发现，这些方法在使用过程中存在着明显的局限性。

(1)平板对峙法，拮抗细菌与病菌之间平板对峙培养法，通常在两者之间会形成一明显的抑菌带(约3mm～18mm)，此法操作比较简便，适合于拮抗细菌的初筛，但拮抗细菌形成的抑菌带大小不仅与拮抗细菌自身分泌的代谢产物抑菌活性有关，还与菌株代谢产物在培养基上扩散能力有关，人们采用平板对峙法通常以抑菌带宽度值作为评价拮抗菌株抗菌能力的指标，而保留抑菌带宽度值大的菌株，淘汰抑菌带宽度值小的菌株。我们由此会失去一个因分泌的代谢产物在培养基扩散能力差，而代谢产物抑菌活性强的好菌株。现实中生物农药的研制常常是利用菌株代谢产物的抗菌特性。因此采用此法，并不能真正反应出拮抗细菌潜在的抗菌能力。再者用此法试验稳定性、重复性差，同一拮抗细菌点接后，菌落大小并不完全一样，抑菌带宽度值因而也会出现差异。

(2)菌体直接作用测定法，通常是在平板上涂抹拮抗细菌菌液(菌苔稀释液或含菌体的发酵液)，或利用拮抗细菌菌液与培养基混合制平板，然后在含拮抗菌的平板上接入病菌块，测定病菌菌落生长直径，采用此法，细菌可快速占领平板培养空间，对病菌生长影响极大，生测效果不明显，无法真实反应出细菌代谢产物的抗菌活性。

(3)三明治法，在两层培养基中间为一层培养基与拮抗菌菌液(含活菌体)的混合体。然后在上层培养基中接入病菌块，但此法在制作上层培养基的过程中容易使中间层培养基的菌体携入，从而影响拮抗细菌对病菌菌落的生物活性测定。而且在培养过程中拮抗细菌是在中层培养基缺乏氧气的条件下生长，势必影响细菌代谢产物的正常分泌。

(4)拮抗细菌无菌发酵液抗菌能力测定法，包括发酵液混于培养基中抑制病菌菌落生长、发酵液抑制病菌孢子萌发，发酵液滤纸片法、发酵液管碟法等，通常用此法评价拮抗细菌发酵液的抗菌活性，但是在制备拮抗细菌无菌发酵液过程中常采用细菌过滤器过滤获得无菌滤液，在操作上不方便，易造成污染，且费用较高，而采用高温灭菌法制备的无菌滤液可能导致发酵液中部份不耐高温的代谢物失活，影响拮抗菌发酵液真实抗菌能力的发挥。此外，采用拮抗细菌无菌发酵液抗菌能力测定法还受于拮抗细菌发酵培养液培养过程中、细菌培养液培养无菌过滤和检测等诸多因素的制约，达不到快速大量测定的目的。发酵液滤纸片法，作用效果不明显，滤纸片风干时易污染。含发酵液培养基法，由于添加不同浓度的发酵液于培养基中，一定程度上会影响培养基的营养成份和凝固性，从而影响菌的正常生长。发酵液管碟法，加样量少，受管底和管壁的作用，一定程度上会影响细菌发酵液的扩散方向和扩散量，生测时形成的抑菌斑不规则，从而影响试验结果的准确性，操作上复杂、耗时耗财。

发明内容