[发明专利]一种改进的拮抗细菌生物测定方法

权利要求书

1.一种改进的拮抗细菌生物测定方法，其特征在于：采用双层培养基滤纸夹心法，将一定浓度细菌培养液或菌苔稀释液均匀涂抹于上层培养基中，拮抗细菌在上层培养基生长产生的代谢分泌物会通过滤纸层均匀扩散到下层培养基中，移去滤纸及其携带的上层培养基，下层培养基即为含拮抗细菌代谢分泌产物的平板，易于进行对多种病原真菌菌丝生长、孢子萌发及细菌生长的生物测定；

在拮抗菌和病原菌已培养基础上，按照如下步骤进行：

1)根据病原真菌和拮抗细菌的种类制作适合病原真菌生长的常规培养基和适合拮抗细菌生长的常规培养基；

2)制作无菌滤纸平板模：用直径为12cm的滤纸平铺于直径为8.9cm玻璃培养皿中，超出宽度1.5cm的滤纸边缘使之皱褶，并置于平皿中高压灭菌，无菌滤纸平板模成形备用；

3)制作适合病原真菌生长的下层培养基，在直径为8.9cm玻璃培养皿中加入10ml的适合病原真菌生长的常规培养基为下层培养基，厚度为3～4mm，凝固后待用；

4)移入无菌滤纸模：在下层培养基上方移入无菌滤纸模，皱褶处贴于培养皿皿壁，平板处浸湿并紧贴于培养基；

5)制作适合拮抗细菌生长的上层培养基：在无菌滤纸模上加入10ml的适合拮抗细菌生长的常规培养基为上层培养基，凝固后待用，上层培养基通过滤纸模与下层培养基分隔；

6)培养待测拮抗细菌：吸取细菌液均匀涂抹于上层平板中，于适宜细菌生长的条件下培养，培养48h后，上层适合拮抗细菌生长的常规培养基上均匀长满拮抗细菌；

7)移出无菌滤纸模：拮抗细菌培养48h后，细菌分泌的代谢产物会通过滤纸层向下层适合病原真菌生长的常规培养基均匀扩散，此时移出的含上层培养基的滤纸模，含细菌分泌的代谢产物的下层培养基可作为生物测定试材；

8)培养目标病原真菌：在含细菌代谢分泌产物的下层适合病原真菌生长的常规培养基中央接入菌龄一致的待测病菌菌饼，于适宜病菌生长的条件下培养；

9)实验结果测量：待测病菌生长4～7d后测量病菌菌落直径；以不接种拮抗细菌的处理为空白对照，设多个重复；

10)筛选拮抗细菌：通过实验结果分析比较拮抗细菌的抑菌能力，完成拮抗细菌生物测定，真实评价拮抗细菌对病菌的生测效果，正确筛选出抑菌效果好的拮抗菌株。

2.根据权利要求1所述的改进的拮抗细菌生物测定方法，其特征在于：所述适合病原真菌生长的常规培养基为常规的PDA培养基。

3.根据权利要求1所述的改进的拮抗细菌生物测定方法，其特征在于：所述适合拮抗细菌生长的常规培养基为常规的NA培养基。

4.根据权利要求1所述的改进的拮抗细菌生物测定方法，其特征在于：所述的直径为12cm的滤纸采用高速101型。

5.根据权利要求1所述的改进的拮抗细菌生物测定方法，其特征在于：所述步骤8)中的待测病菌菌饼的直径为0.5cm。