[发明专利]一种检测DNA单核苷酸多态性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测DNA单核苷酸多态性的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。

单核苷酸多态性是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。基因组DNA中单核苷酸多态性的分析和测定是遗传病诊断和药物开发的重要工具，还可用来绘制基因图谱、分析人口结构、进行基因联合研究。

单核苷酸多态性分析方法常采用电泳分析和固相杂交的方法，如：DNA测序、限制酶切片段长度多态性分析、单链DNA构象多态性分析、异源双链核酸分析、等位基因特异性寡聚核苷酸杂交、错配酶切分析、寡聚核苷酸连接分析等，需要繁琐的分离或洗涤程序，增加了检测时间。采用均相检测方法可以避免上述问题，目前的均相检测方法均基于荧光偏振或小分子荧光染料之间的荧光共振能量转移，偏振化荧光的强度大大降低，导致了基于荧光偏振的方法灵敏度不高；基于荧光共振能量转移的方法均要对探针分子进行双修饰，导致成本很高。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA单核苷酸多态性的检测方法。

本发明所提供的检测DNA单核苷酸多态性的方法，依次包括以下步骤：

1)以待测样本的DNA为模板进行PCR扩增，并用荧光物质标记待测样本的DNA；

2)通过所述荧光物质与下述式(I)的化合物荧光共振能量转移情况确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸；所述荧光物质的吸收光谱与所述式(I)的化合物发射光谱有较好的重叠，光谱重叠积分范围为1.0×10^-15～3.0×10^-13M^-1cm³；

式(I)中，R代表链端含有四级胺的直链或支链的烷基，所述烷基的主链长为2-12个碳，X代表卤素；

所述式(I)化合物的数均分子量为5000-100000。

所述式(I)中，R具体可为6-三甲胺基己基、6-三乙胺基己基、5-三甲胺基戊基、5-三乙胺基戊基、4-三甲胺基丁基、4-三乙胺基丁基、3-三甲胺基丙基和3-三乙胺基丙基中的任意一种。

所述式(I)中，X具体可为氯、溴和碘中的任意一种。

所述用荧光物质标记步骤1)的DNA的方法可为：用荧光物质标记的dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dUTP)或ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP、ddUTP)对PCR扩增产物进行单碱基延伸；所述dNTP或ddNTP为与所述目标单核苷酸多态位点的核苷酸相邻(上游或下游)的一个核苷酸互补的dNTP或ddNTP。

所述单碱基延伸中，所用的引物有两种：野生型特异性引物和突变型特异性引物；所述野生型特异性引物的末端(5′或3′)核苷酸与所述目标单核苷酸多态位点的野生型核苷酸互补；所述突变型特异性引物的末端(5′或3′)核苷酸与所述目标单核苷酸多态位点的突变型核苷酸互补；所述引物能与所述目标单核苷酸多态位点相邻(上游或下游)20-25bp的序列互补。

确定所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点核苷酸的方法可为：若只在使用野生型特异性引物时出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为野生纯合型；若只在使用突变型特异性引物时出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为突变纯合型；若使用两种引物都出现荧光共振能量转移，则所述待测DNA的目标单核苷酸多态位点的核苷酸为杂合型。