[发明专利]利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域和纳米技术领域，涉及一种利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法。

背景技术

纳米技术作为本世纪的前沿技术已受到许多国家的极大重视，但是伴随纳米科学技术的高速发展，不仅使人们已经认识到纳米材料的优点和巨大的潜力，同时纳米材料也会对人类产生许多负面效应。纳米材料由于尺寸小，具有特殊的理化性质，与常规物质相比更容易进入细胞并影响细胞的功能。已有报道显示具有纳米尺度的颗粒会引发生物体免疫系统的炎症反应，造成哮喘甚至心血管疾病。随着纳米材料越来越多的出现在人类的生产和生活中，纳米材料生物效应(安全性)的研究迫在眉睫，这将关系到纳米技术的广泛应用及长远发展。

生命的遗传是基因组DNA准确地复制的过程，复制过程中突变率的改变必将引起基因突变，从而诱发癌变，因此分析不同种类的纳米材料对基因扩增准确度所带来的影响可以从分子水平探索纳米材料的生物安全性问题。基因不仅可以在细胞中进行复制，在体外也可以通过聚合酶实现基因扩增。其中聚合酶链式反应(PCR)是一种在体外模拟DNA体内复制的基因扩增技术，能在耐热DNA聚合酶的作用及特异性引物的引导下，在很短的时间内就能在一个试管内实现只有在生物体细胞分裂增殖时才出现的基因的大量复制，一般来说，在数小时内就可以将目的基因扩增至百万倍。此外，滚环扩增技术(RCA)、链置换扩增技术(SDA)等技术也可以实现体外基因扩增。因此将纳米材料添加到基因扩增体系，对产物突变率的检测可以研究纳米材料对突变率的影响，从分子水平研究纳米材料的生物安全性。

对基因突变的鉴定，最为关键的是建立一个高效、稳定的检测体系。传统的基因扩增突变的检测采用lac I基因突变研究系统，它以lac I作为突变测定的靶基因，同时以lacZ作为报告基因，通过常规的蓝白颜色筛选实验来鉴定靶基因的突变。因为PCR等技术所产生的体外基因突变是一种低频率事件，这种根据菌落的颜色来筛选靶基因突变的方法是一种非选择性方法，所以在进行大量分析时要消耗大量的原材料和劳动力。近年来报道的rpsl基因正向选择系统中，只有rpsl突变型菌能够在含有链霉素的平板形成菌落，实现正向选择靶基因突变子的目的。此外，rpsl分析背景较低，因为rpsL的自发突变率低至10^-6，远低于同类筛选体系。目前，rpsl基因正向选择系统以其有效性和实用性成为体外基因扩增保真度检测的有力工具。本发明即利用rpsl基因正向选择系统考察纳米材料的分子安全性问题，不需lacI突变研究系统中大量试剂的耗费，而且大大节省了对突变率检测的工作量，可以实现大规模的突变率的筛选。

发明内容

本发明的目的在于结合分子生物学技术，提供一种利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法，本方法通过在体外基因扩增反应体系中添加纳米材料，利用正向选择系统对反应产物的突变进行筛选，达到定量检测纳米材料生物安全性的目的；本方法技术先进，检测结果准确可靠，使用成本较低。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法，检测方法的步骤是：

(1)纳米材料的灭菌：将所检测的纳米材料除菌、灭DNA酶和RNA酶；

(2).纳米材料悬浮溶液的制备；以纳米材料完全悬浮且在室温下可静止放置至少10min而不发生聚积沉淀现象为准；

(3)体外扩增带有rpsl基因的质粒模板：

①.体外基因扩增体系的配置：具体表现在dNTP、模板、Mg²⁺、引物的添加量应根据模板和体外扩增技术来选择，且在上述反应体系中加入纳米材料悬浮溶液；

②.基因扩增条件的设定与运行：反应体系中的预变性、变性及退火各阶段的温度和对应时间根据模板和引物融解温度来选择，或者反应温度根据所用聚合酶的温度来选择，延伸时间根据所扩增片段的长度来选择；

③.基因扩增产物的纯化：扩增产物用限制性内切酶在37℃进行消化反应，然后纯化；

(4).基因扩增产物的自身连接：经纯化的扩增产物用T4 DNA连接酶在16℃连接；

(5).重组质粒的转化和正向选择系统：采用CaCl₂方法转化MF101感受态细胞，转化后的MF101细胞涂板于含氨苄青霉素的100μg/ml平板上以确定转化细胞的总数，涂板于含氨苄青霉素和链霉素100μg/ml平板上以确定rpsL基因突变的总数；

(6).基因扩增突变频率和错误率的计算：

突变频率＝突变总数÷转化细胞总数；