[发明专利]利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法

权利要求书

1.一种利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法，其特征在于：检测方法的步骤是：

(1).纳米材料的灭菌：将所检测的纳米材料除菌、灭DNA酶和RNA酶；

(2).纳米材料悬浮溶液的制备；以纳米材料完全悬浮且在室温下可静止放置至少10min而不发生聚积沉淀现象为准；

(3).体外扩增带有rpsl基因的质粒模板：

①.体外基因扩增体系的配置：具体表现在dNTP、模板、Mg²⁺、引物的添加量应根据模板和体外扩增技术来选择，且在上述反应体系中加入纳米材料悬浮溶液；

②.基因扩增条件的设定与运行：反应体系中的预变性、变性及退火各阶段的温度和对应时间根据模板和引物融解温度来选择，或者反应温度根据所用聚合酶的温度来选择，延伸时间根据所扩增片段的长度来选择；

③.基因扩增产物的纯化：扩增产物用限制性内切酶在37℃进行消化反应，然后纯化；

(4).基因扩增产物的自身连接：经纯化的扩增产物用T4 DNA连接酶在16℃连接；

(5).重组质粒的转化和正向选择系统：采用CaCl₂方法转化MF101感受态细胞，转化后的MF101细胞涂板于含氨苄青霉素的100μg/ml平板上以确定转化细胞的总数，涂板于含氨苄青霉素和链霉素100μg/ml平板上以确定rpsL基因突变的总数；

(6).基因扩增突变频率和错误率的计算：

突变频率＝突变总数÷转化细胞总数；

错误率＝突变频率÷(130×25)；

其中130为构成rpsL表型变化的氨基酸数，25为模板加倍数。

2.根据权利要求1所述的利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法，其特征在于：所述的纳米材料是指：水溶性和非水溶性产品、修饰与未修饰产品，还包括颗粒大小各异的产品，或者具备以上一种或多种不同性质组合的产品。

3.根据权利要求1所述的利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法，其特征在于：所述的纳米材料悬浮溶液是指：纳米材料均匀分散在纯水或者PCR缓冲液或者其它适用于基因扩增反应的液相中。

4.根据权利要求1所述的利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法，其特征在于：所述的体外基因扩增技术包括：聚合酶链式反应、滚环扩增技术、链置换扩增技术、低拷贝数DNA扩增、长片段PCR、复杂模板PCR、反复扩增的PCR以及含有较多重复序列的DNA片段的扩增。