[发明专利]大肠杆菌热敏性肠毒素双突变体作为疫苗黏膜免疫佐剂

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及大肠杆菌热敏性肠毒素 双突变体，其编码基因，含有该基因的载体或细胞，含有该蛋白的佐剂组合物， 以及该蛋白的生产方法。

背景技术

黏膜免疫是机体免疫防御体系中重要的一环，通过黏膜进行免疫预防不仅 能诱导黏膜部位产生免疫抗体，还可刺激全身性的免疫应答，因此黏膜免疫接 种是预防呼吸道、消化道系统疾病的最佳免疫途径。但由于许多疫苗在黏膜接 种时诱导产生的抗体水平低，不能产生足够的免疫保护，因此需要合适的黏膜 佐剂配合，才能诱导出具较高水平的黏膜IgA抗体。目前研究的黏膜免疫佐剂 有很多种，其中由细菌代谢产物，热敏性肠毒素和霍乱菌毒素作为疫苗黏膜免 疫佐剂的研究尤为令人关注。

Enterotoxic Escherichia coli(ETEC)所产生的热敏性肠毒素 (heat-labile enterotoxin，LT)是引起人及哺乳动物腹泻的毒素之一，由1 个A亚基和5个B亚基所组成。B亚基主要可调控LT与细胞膜上的GM1结合， A亚基具有ADP-核糖转移酶活性，是主要的毒力因子。完整的LT A亚基可被 胰酶裂解为A1和A2，A2位于A1的C末端，二者以二硫键相连，其中A1是毒 性部位，A2与LT B亚基相连。进入靶细胞后，二硫键被还原，LT表现出毒性。

许多研究表明，LT是一种有潜力的黏膜免疫佐剂，但由于LT具有很强的 毒性而限制了其在临床上的应用。目前人们正试图通过定点突变技术，达到降 低LT毒性、同时又保留其佐剂功能的目的。研究发现与LT的毒性相关的位点 主要集中在A亚基上，通过改变氨基酸位点可达到降低LT毒性的目的。很多 位点的突变都会影响其ADP-核糖转移酶活性，比较常见的有第7、44、49、50、 63、72、110、112、146等位点的突变体，这些突变体分别表现出不同程度的 残余毒性和不同程度的佐剂活性，结论不一。

现有技术中的LT突变体研究主要集中在单一位点突变体构建上，而单一 位点突变体毒性可能没有完全丧失，并且出现回复突变而重新获得毒力的机率 较大。而构建多位点的LT突变体，理论上其回复突变的可能性就会降低，然 而多位点的突变是否会影响LT作为黏膜免疫佐剂的活性还未可知，且还需要 寻找合适的多突变位置组合，以使LT在毒性降到最低的情况下发挥尽可能强 的免疫佐剂活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种毒性低、免疫佐剂活性优异的大肠杆菌热敏性 肠毒素双突变体，其编码基因，含有该基因的载体或细胞，含有该蛋白的佐剂组 合物，以及该蛋白的生产方法。

在本发明的第一方面，提供一种分离的大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白， 所述的蛋白包括大肠杆菌热敏性肠毒素蛋白的A亚基和B亚基，且该A亚基的氨基 酸序列相对于野生型大肠杆菌热敏性肠毒素的A亚基的氨基酸序列，

其第63位为K，且第192位为G；

其第72位为R，且第192位为G；或

其第63位为K，第72位为R，且第192位为G。

在另一优选例中，所述的蛋白含有1个大肠杆菌热敏性肠毒素蛋白的A亚基， 和5个大肠杆菌热敏性肠毒素蛋白的B亚基。

在另一优选例中，所述的蛋白基本上由大肠杆菌热敏性肠毒素A亚基和B亚 基构成。

在另一优选例中，所述的蛋白基本上由1个A亚基和5个B亚基复合而成。

在本发明的第二方面，提供一种分离的核酸，所述的核酸编码所述的蛋白。

在本发明的第三方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的核酸。

在本发明的第四方面，提供一种细胞，所述的细胞内含有所述的载体，或其 基因组中整合有所述的核酸。

在本发明的第五方面，提供一种生产所述的蛋白的方法，包括：在适于表达 的条件下，培养所述的细胞，从而表达所述的蛋白。

在另一优选例中，所述的方法包括：

(1)在细胞内表达大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的A亚基和B亚基；

(2)收集(1)的细胞，用变性剂重悬后将细胞破碎；

(3)将(2)的细胞破碎产物混匀，离心收集上清；

(4)从(3)获得的上清中分离含有A亚基与B亚基的蛋白，复性，获得所 需蛋白。

在另一优选例中，所述的变性剂是NTAO。