[发明专利]一种用于DNA检测的纳米金信号探针及其制备方法和DNA检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种用于DNA检测的纳米金信号探针及其制备方法和应用该纳米金信号探针的DNA检测的方法。

背景技术

DNA检测在临床诊断、单核苷酸多态性分析、DNA测序、法医学鉴定、器官移植、环境分析、反恐等领域具有重要的意义。随着人们对自身健康的日益关注，迫切需要能对各种重大疾病进行早期诊断和治疗，这就需要对致病基因进行高灵敏度的检测。然而，由于发病早期体内致病基因的含量非常低，无法对其进行直接检测，常常需要对待检基因或信号进行放大。目前，常用的放大方法包括聚合酶链反应(M.C.Estes，J.S.Sevall，Mol.Cell Probes2003，17，59)、bio-bar-code放大(J.M.Nam，C.S.Thaxton，C.A.Mirkin，Science 2003，301，1884；J.M.Nam，S.I.Stoeva，C.A.Mirkin，J.Am.Chem.Soc.2004，126，5932)和共轭高分子放大(L Chen，D.W.McBranch，H.Wang，R.Helgeson，F.Wudl，D.G.Whitten，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.1999，96，12287)等。然而，这些方法有的比较繁琐，费时、昂贵，有的又存在选择性和灵敏度较低的不足。因此，迫切需要发展新的简便、经济、无需标记并且选择性和灵敏度较高的方法来满足对微量样品的检测。

纳米技术的发展为生物分子的高灵敏度检测提供了新的思路。以纳米金、荧光量子点和磁性颗粒为典型代表的纳米颗粒，已被广泛应用于生物分子的固定，信号的放大以及待测物质的富集和浓缩。纳米金颗粒因具有优异的光学性能，巨大的比表面积以及形状与性能的可调控性，目前已陆续开发出了多种基于纳米金的新型DNA检测技术。

美国西北大学的Mirkin研究组(R.Elghanian，J.J.Storhoff，R.C.Mucic，R.L. Letsinger，C.A.Mirkin，Science 1997，277，1078)最先发展了一种纳米金表面组装DNA的方法。通常所用的纳米金是通过柠檬酸钠还原法制备的，表面包覆了一层负电荷的柠檬酸根离子。巯基修饰的DNA(SH-DNA)可与纳米金形成强的Au-S共价键，使包覆在纳米金表面的柠檬酸根离子被SH-DNA取代，从而将DNA牢固的组装在纳米金表面。由于纳米金颗粒具有光学性质随聚集状态(颗粒间距)的不同而变化的特点，因此通过DNA之间的杂交，可以使纳米金颗粒之间的距离发生改变，从而产生颜色的变化。基于此原理，他们实现了对单核苷酸多态性的检测。目前，DNA修饰的纳米金(DNA-AuNP)已经被广泛研究和使用，如作为分子尺、基因和蛋白质检测、DNA三螺旋的组装、金属离子检测以及DNA连接分子的检测等。

由于每个纳米金颗粒表面可以同时组装多个DNA分子，这为信号放大提供了一个很好的思路。Mirkin等(J.M.Nam，C.S.Thaxton，C.A.Mirkin，Science 2003，301，1884)就发展了一种称为“bio-bar-code”的放大方法。这种方法采用磁性颗粒来连接捕获探针，可以从混合介质中特异性的捕获到靶序列；采用DNA-AuNP纳米颗粒作为信号探针，通过DNA之间的杂交形成三明治夹心结构，最后将纳米金颗粒表面的DNA分离下来进行检测，靶分子的量与分离下来的DNA的量直接相关，因此可以实现基因的检测。这种方法非常灵敏，但是需要将DNA从纳米金表面分离下来再进行检测，增加了反应的步骤。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于DNA检测的纳米金信号探 针，应用其进行DNA检测无需将DNA从纳米金表面分离下来再进行检测，步骤简便，而且具有较好的灵敏度和选择性。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种所述的纳米金信号探针的制备方法。

酶催化底物反应具有专一性强、速度快、效率高的特点，常被用于DNA的放大检测。在含有受检物质和酶的标本中加入酶反应的底物后，底物被酶催化生成具有颜色或荧光的产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，所以可根据颜色深浅或荧光强弱进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使检测方法达到很高的灵敏度。本发明人发现，酶或其它一些能自身反应生成具有颜色或光学性质的蛋白质可与纳米金吸附结合，故本发明人将纳米金的放大功能与酶促反应的放大功能有机结合起来，用以检测DNA。结果本发明人惊奇地发现不仅无需将DNA从纳米金表面分离下来再进行检测，简便了步骤，而且保持了较好的灵敏度和选择性。