[发明专利]大肠杆菌O157恒温核酸扩增快速检测试剂盒及其用法

说明书

技术领域

本发明涉及一种恒温核酸扩增检测方法，具体涉及一种大肠杆菌O157恒温核酸扩增快速检测试剂盒及其用法。

背景技术

肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157是一种重要的人兽共患病病原菌.主要通过食物和水源传播，该病可引起腹泻、出血性肠炎、继发溶血性尿毒综合症(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等。HUS和TTP的病情凶险，病死率高。自1982年美国首次分离出该菌以来，世界各地不断有散发和暴发的报告。我国近几年已陆续有十多个省份在食品、家禽、家畜、昆虫和腹泻病患者中检出该致病菌，存在着疫情暴发、流行的潜在威胁。由于大肠杆菌0157感染剂量极低，食入不足100个细菌就可引起疾病，且病程急，病情严重；此外，除临床样品外，对水及食品等微生物区系复杂的样品进行检测时，在这些样品中致病菌的数量可能很少，因此筛检大肠杆菌O157的方法是否灵敏、特异及快速至关重要。随着分子生物学技术的飞速发展使这种要求成为可能。

采用特异序列的原位扩增可便于探测细菌细胞内部的单拷贝功能基因。多种版本的原核原位PCR(聚合酶链反应)和反转录PCR(聚合酶链反应)法已经发展到可以探测单细胞的特异基因的水平。早期的报告指出，HNPP-Fast Red TR体系曾用于原位PCR产品的高灵敏度检测。然而，原位PCR有许多不利的因素：(1)由于透化作用与热循环的作用，扩增产品中的细胞被损坏，这使得我们难以使用荧光标记抗体来进行同步的细胞识别；(2)细胞壁的不渗透性和由DNA聚合酶抑制剂引起的PCR扩增反应中的干扰会产生假的阴性结果；(3)已标记的扩增产物的扩散，及包含它的细胞所引起的阳性结果，或者通过切口转译活动产生的非特异性结合的有标记的核苷酸所引起的阳性结果，都会造成假阳性结果。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种大肠杆菌O157恒温核酸扩增快速检测试剂盒及用法。

为达到本发明的目的，采用以下技术方案：

本发明的一种大肠杆菌O157恒温核酸扩增快速检测方法，其试剂包括：

①引物混合液：混合液中四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如下：

外引物1：GCTATACCACGTTACAGCGTG；

外引物2：ACTACTCAACCTTCCCCAGTTC；

内引物1：GCTCTTGCCACAGACTGCACATTCGTTGACTACTTCTTATCTGG；

内引物2：CTGTGACAGCTGAAGCTTTACGCGAAATCCCCTCTGAATTTGCC；

②磷酸缓冲液；

③多聚甲醛：为2-4％质量；

④多聚赖氨酸：为0.03-0.05％质量；

⑤溶菌酶溶液：浓度为0.6-0.8mg/ml；

⑥蛋白酶K：浓度为0.1-0.3mg/ml；

⑦RNA酶：浓度为1-2mg/ml；

⑧Bst DNA聚合酶(嗜热脂肪芽胞杆菌DNA酶大片段)：浓度为8U/μl；

⑨反应缓冲液：10mM dNTP(脱氧核糖核苷酸)∶10×ThermoPol(耐热聚合酶)反应缓冲液∶150mM MgSO₄＝8∶5∶2体积；

⑩样品预处理液：pH 7.0-8.0、20mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，2mM EDTA(乙二胺四乙酸)，1.2％ Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)；

显色剂：荧光染料1-2mg/ml DAPI(4，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐)；

系列浓度乙醇溶液：为30-70％体积乙醇、70-90％体积乙醇、90-100％体积乙醇；

阳性对照为O157大肠杆菌基因组DNA，阴性对照为不含模板的反应混合液。

所述的磷酸缓冲液组分为：137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na₂HPO₄，pH 7.0-8.0、1.5mMKH₂PO₄。

用上述试剂盒检测大肠杆菌O157的方法包括以下步骤：

(1)被检样品的预处理：将待检测样品悬浮于磷酸缓冲液中，离心，取上清液；上清液依次做10倍稀释度稀释，每个稀释度取0.5-2ml涂平板进行细胞计数；离心，沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，2-4％质量多聚甲醛固定15-20h；细胞悬浮液10-40μl滴加到用0.03-0.05％质量多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，风干；