[发明专利]一种提取食用油脂中核酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取食用油脂中核酸的方法。

背景技术

DNA提取技术的建立是保障PCR或相应下游实验顺利进行的关键，到目前为止，保存较好的生物材料、加工或部分深加工生物材料基本均可做到利用生物技术领域熟知的DNA提取技术(普通DNA提取试剂或利用市售特殊装置如：纯化柱法、磁珠法、超滤离心法等)顺利完成适用DNA的提取过程。就利用PCR等技术进行下游实验而言，许多实验室经常遇到特殊的实验材料难以提取到适用于PCR或相应下游实验的DNA的问题，食用油脂是该特殊实验材料中的一种。多年来，国内外诸多相关实验室均力图建立可重复的、稳定的食用油脂中适用于PCR或相应下游实验的DNA提取方法，但至今尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可重复的、稳定的食用油脂中适用于PCR的DNA的提取方法。

为了达到上述目的，本发明所述的提取食用油脂中核酸的方法，按照以下步骤进行：

(1)食用油脂中极性成分的萃取

采用水作为萃取剂，用离心的方法进行油液分离；

(2)萃取液的浓缩

全部转移萃取液于电热恒温干燥设备或其它干燥设备内，充分干燥；

(3)食用油脂中DNA的粗提；

(4)粗提DNA的纯化。

上述步骤(1)中，在萃取过程中，必须采取离心等方法去除油水界面物质，根据下层水相浑浊程度分多次共需萃取初榨大豆油约400mL-600mL、初榨菜籽油约700mL-1000mL、初榨玉米油约700mL-1000mL、各种精练油约2000-3000mL、花生油、芝麻油等约400mL-600mL、棕榈油600mL-800mL。

当待测油脂为初榨大豆油时，步骤(3)中DNA的粗提按照以下方法进行：取预热至约80-90℃ CTAB提取液8-10mL，分多次小心洗下表面皿上干燥的萃取物，吸取洗下的萃取物转移至15mL离心管。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s，7500×g室温离心10min；分别小心吸取上清至另一15mL离心管，再次加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，操作同上，小心吸取上清，上清加入0.2至0.3倍体积的预冷异丙醇，充分上下倒置混匀，置0℃约20-40min后10000-12 500×g，4℃离心6min，沉淀置0℃待用；上清于27 000-30 000×g，4℃离心10min，弃取上清，沉淀加入500μL 70％-80％预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27 000-30 000×g，4℃离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥；上述10 000-12 500×g离心所获沉淀加入约1200μL 70％-80％预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27 000-30 000×g，4℃离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。

当待测的油脂为初榨菜籽油、玉米油、花生油、芝麻油、棕榈油、棉籽油或各种精炼油等时，步骤(3)中DNA的粗提按照以下方法进行：取预热至约80-90℃ CTAB提取液8-10mL，充分溶解干燥的萃取物于15mL离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s，7 500×g室温离心10min；上清按1/10体积加入3M NaAc，混匀，加入LA溶液，混匀，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃静置约40min-60min后，27 000-30 000×g，4℃离心10min，弃取上清，沉淀加入500μL 70％-80％预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27 000-30 000×g，4℃离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。

所述步骤(4)粗提DNA的利用特制的长片段核酸富集纯化装置来进行，该长片段核酸富集纯化装置包括一个筒状主体1，在两端开口端口包覆半透膜2，在筒状主体上设有取液孔3和加样槽4，取样孔3带有胶塞5。在加样槽下方的部分筒状主体内充填有琼脂糖凝胶，而取液孔下方的部分筒状主体保持为空腔，用作注入电泳缓冲液。具体的操作方法如下：

(a)电泳槽加入电泳缓冲液；

(b)取液孔下方的部分筒状主体的空腔加满电泳缓冲液，并盖紧取液孔胶塞；

(c)将核酸富集纯化装置浸入电泳槽内电泳缓冲液中；

(d)待纯化核酸与上样缓冲液(含指示染料)混匀后，加入到加样槽，并通电；

(e)待指示染料条带全部进入取液孔下方缓冲液中，弃去取液孔下方的缓冲液；

(f)重新注满电泳缓冲液于取液孔下方的空腔，盖紧取液孔胶塞，重新放入电泳槽中，继续通电电泳，收集取液孔下方空腔的缓冲液进行酚氯仿抽提。