[发明专利]用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物化工领域，涉及由红酵母提取的含羰基还原酶以及甘露醇脱氢酶的还原酶制剂的制备，及其用于羰基化合物还原制备相应光学活性手性仲醇的方法。

背景技术：

光学活性手性仲醇是很多医药、农药、香料以及其它精细化学品合成的重要中间体，其合成有多种方法，包括化学法催化手性仲醇的不对称合成以及生物催化的手性拆分或不对称合成。化学法催化酮的不对称还原合成光学活性手性仲醇，通常需要结构复杂的过渡金属配合物作为催化剂，催化剂价格昂贵，制备和回收比较困难、对环境有较严重的污染，其生产应用受到限制。生物法合成光学活性手性仲醇具有成本低、产品光学纯度高，无环境污染等独特优点，其研究、开发和应用备受国内外广泛关注。

目前生物催化法制备光学活性手性仲醇的途径主要有两种：一是通过脂肪酶催化对外消旋手性仲醇的对映体进行动力学拆分；二是通过还原酶催化对潜手性酮的羰基进行不对称还原。后一种途径，原料的原子利用率为100％，产物无需复杂的分离、纯化步骤，工艺简便，易于进行工业化生产。但该方法有一个比较大的缺点，酮的还原需要等当量的还原型辅酶(NADH或NADPH)，由于还原型辅酶价格昂贵，为降低合成成本，必须对辅酶进行原位再生和重复使用。辅酶的高效再生是生物催化还原中必须重点解决的技术问题。

用微生物整细胞作为催化剂，细胞内存在着完整的辅酶还原再生系统，在反应体系中添加适量的培养基碳源，如葡萄糖，即可实现辅酶的自身再生，生产成本低。尽管如此，用整细胞催化羰基化合物还原，由于细胞内酶的含量低，因此需要大量的催化剂，催化剂的质量可能达底物质量的几倍甚至几十倍。比如杨忠华等用酵母细胞催化4-氯苯乙酮的还原，底物浓度低于20mM(大约3g/L)，需要加入20g/L的酵母细胞，而产物得率仅33％[见《精细化工》，2007年24卷1期，63-66]。这种方法催化效率比较低下，并且大量细胞的存在给产品的提取、纯化造成一定的困难。

用分离提取的还原酶作为催化剂，通过其它的酶偶联催化可实现还原型辅酶的有效再生，工艺非常简便，催化效率较高[Appl.Microbiol.Biotechnol.，2007，76：237-248]。常用的辅酶再生用酶包括葡萄糖脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶等，但这些酶的价格比较贵，限制了其大规模工业应用。

我们在之前的研究中，发现红酵母CGMCC-1735(保藏于中国普通微生物保藏中心，专利保藏号：CGMCC 1735)可以催化羰基化合物还原合成光学活性手性仲醇[中国发明专利，公开号CN1869197A，公开日2006.11.29]。进一步研究发现，在红酵母CGMCC-1735细胞中除了羰基还原酶之外，还存在甘露醇脱氢酶，其中羰基还原酶以NADPH为辅酶，催化羰基底物脱氢生成光学活性手性仲醇；而甘露醇脱氢酶可以催化甘露醇脱氢生成果糖，以NADP⁺为辅酶，同时实现NADPH的再生，反应示意图如附图1所示。

发明内容：

为了能更经济地生产光学活性手性仲醇，本发明的目是提供一种用红酵母还原剂制剂制备光学活性手性仲醇的方法。

所述红酵母还原酶制剂，其中同时含有羰基还原酶以及甘露醇脱氢酶。

所述红酵母还原酶制剂的制备；按照已申请的发明专利[中国发明专利，公开号CN1869197A，公开日2006.11.29]中的方法对红酵母CGMCC-1735进行发酵培养，离心收获细胞。将红酵母细胞悬浮于Tris-HCl缓冲液中，用高压均质机进行细胞破碎，破碎液高速离心，取离心上清液，其中含有羰基还原酶和甘露醇脱氢酶两种组分，在离心上清液中加入硫酸铵进行蛋白质沉淀，收集35～90％硫酸铵浓度区间的蛋白质沉淀，对含有羰基还原酶和甘露醇脱氢酶的蛋白质沉淀进行冷冻干燥，获得红酵母还原酶粗酶制剂；或者进一步对含有羰基还原酶和甘露醇脱氢酶的硫酸铵沉淀蛋白质进行部分纯化，分离除去杂蛋白，合并含有羰基还原酶和甘露醇脱氢酶的洗脱液，进行冷冻干燥，获得部分纯化红酵母还原酶制剂。通过上述两种方法获得的红酵母还原酶制剂均可用于催化酮的不对称还原，只是酶制剂中羰基还原酶和甘露醇脱氢酶含量不同，催化效率有-定差异。

用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法：