[发明专利]Y型聚乙二醇修饰的G-CSF及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及Y型聚乙二醇修饰的粒细胞集落刺激因子 (YPEG-G-CSF)及其制备方法，以及包含YPEG-G-CSF的药物组合物 及应用。

背景技术

粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor，G-CSF) 是刺激骨髓细胞集落形成的集落刺激因子之一，它能够特异性地刺激和 调节粒细胞系统的增殖、分化、存活和活化，对于各种原因引起的粒细 胞减少症具有潜在的、巨大的应用价值。

人G-CSF基因位于17号染色体q21-22区域，其全长为2.5kb，由5个外 显子和4个内含子构成，成熟蛋白含有174个氨基酸。大肠杆菌表达的 G-CSF在分子的N末端还有一个Met，共有175个氨基酸，如图1(SEQ ID NO：1)所示。该分子共有5个Cys，其中Cys37-Cys43和Cys75-Cys85形成 两对二硫键，分子中有4个Lys残基，分别位于17、24、35和41位上。

化疗引起的中性粒细胞减少症，特别是中性粒细胞减少性发热症 (febrile neutropenia，FN)是癌症患者接受化疗后产生的最普遍，通常也 是最严重的副作用，尤其是在第一个化疗周期。FN带来的结果往往是患 者必须接受住院观察、接受抗生素治疗，不仅增加额外的经济负担，而 且有相当高的死亡率；另一严重的后果是由于中性粒细胞的减少，许多 癌症患者的治疗计划不得不更改，例如降低化疗药物的剂量、推迟下一 化疗周期等，而这些又直接与最终的化疗效果相关。自从1991年FDA批 准rHuG-CSF药物上市以来，已有数百万的接受化疗的癌症患者从中受 益。目前其年销售额已进入世界生物技术药物的前十位，具有非常好的 应用前景。

但是重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)具有在体内循环半衰期短 (t_1/2仅为1.3-4.2h)、作用时间短暂、易被酶水解和肾脏清除、需要多次 注射等问题，这不仅给患者带来了很大的不便，而且重复注射也会引起一 些不良反应，限制其疗效。

近年来发展的聚乙二醇(Polyethylene Glycol，PEG)修饰技术为克 服上述问题提供了一种可能的选择。

聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一类无毒的水溶性中性多聚 体，具有良好的生物相容性和血液相容性，已被美国食品和药品监督管 理局(FDA)批准用于人体局部、胃肠道和静脉给药。蛋白质的PEG修饰 技术是指PEG两端的一个或二个端基被活化后具有一定的官能团，该官 能团对要结合的蛋白质中的至少一个官能团具有活性，通过共价键合使 PEG结合到蛋白质的端头(N端或C端)或特定氨基酸上；PEG作用位 点具有普遍性。

PEG是乙二醇和环氧乙烷聚合物，别名碳蜡，结构式为：

CH₂〔OH〕-〔CH₂CH₂O〕n-CH₂OH

常规PEG随分子量增大，其外观由无色粘稠液体(190-630Dalton)、 白色膏状体(950-1050Dalton)至白色蜡状或片状固体(＞1200Dalton) 而变化。用于蛋白质及其它药物修饰的PEG通常分子量巨大(表1)， 如美国罗氏公司已上市产品Pegasys(聚乙二醇干扰素α2a注射液，派罗 欣)采用的U型分支双链PEG分子量为40KD，美国先灵葆雅公司已上 市产品Peg-Intron(聚乙二醇干扰素α2b注射液，佩乐能)采用的直链线 性PEG分子量为12KD，美国Amgen公司已上市产品(聚乙二 醇粒细胞集落刺激因子)采用的直链线性PEG分子量为20KD。药物中 的PEG部分(或PEG)在体内的代谢过程已相当清楚，经证实其是一种 良好的、安全的、无副作用的药物改性剂。

表1.目前已上市PEG化蛋白质药物的一些基本理化性质参数[18]