[发明专利]一种发酵生产3-羟基丙酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种3-羟基丙酸的生产方法，具体地说涉及一种采用皱褶假丝酵母(Candida rugosa)进行发酵生产3-羟基丙酸的方法。

背景技术

3-羟基丙酸(3-hydroxpropionic acid，简称3-HP，下同)是一个三碳无手性有机酸，与乳酸互为同分异构体，具有羟基和羧基两种官能团。3-羟基丙酸无色、无味、油状，可与水、醇、醚等多种有机溶剂互溶，广泛应用于涂料、胶粘剂、水处理化学品和个人护理用品的生产；同时，3-羟基丙酸是近年来兴起的一种重要的化学中间体，它脱水生成丙烯酸、氧化生成丙二酸、与醇酯化作用生成酯、还原生成1，3-丙二醇等。

目前，3-羟基丙酸的制备法主要依靠化学法。通过将邻卤代醇与氰化钾作用生成的3-羟基丙腈水解或Reformat sky反应可制备3-羟基丙酸。丙烯酸催化水解也可得到3-羟基丙酸，这是市场上3-羟基丙酸的主要来源。由于丙烯酸和丙烯腈易燃，且工艺需高温，故安全性较低、对设备要求高。受丙烯酸的原料来源限制，该法生产的3-羟基丙酸已远不能满足市场需求。同时，3-羟基丙酸传统生产工艺还存在能耗高、污染大、副产物多、分离困难等缺点，这在很大程度上限制了该技术的进一步发展。

生物转化法制备3-羟基丙酸已有一定的研究。1968年Harada和Hirabayashi研究Hansenula miso对醇的利用时发现该菌株可氧化1，3-丙二醇得到3-羟基丙酸。1974年Miyoshi和Harada在研究Fusarium merismoides对1，4-丁二醇利用过程中，发现该菌可利用丙酸羟基化生产3-羟基丙酸。1982年，Hasegawa等发现一株不积累丙酸，而能以丙酸为底物生产3-羟基丙酸的突变株，丙酸转化率达89％。1994年Takamizawa等利用微生物转化丙烯酸生产3-羟基丙酸，其底物原料还可以为丙醇、丙酸、丙醛、丙烯酸、1，3-丙二醇等。但是这些过程的生产周期长，产物得率较低，制约了生物转化生产3-羟基丙酸的产业化进程，应用前景有限。

近年来，日本专利和美国专利分别描述了构建基因工程菌以甘油或葡萄糖为底物直接发酵生产3-羟基丙酸的生物转化路线。但这些过程需要修改大量基因，难度很大，尚未见产业化报道。Suthers等在1999年把来自肺炎克雷伯氏菌甘油脱水酶基因和来自酵母的醛脱氢酶基因克隆到大肠杆菌，构建了由甘油生产3-羟基丙酸的大肠杆菌工程菌。但该工程菌产量较低，达不到工业生产的要求。后来日本学者对此进行了改进，以二醇脱水酶替代甘油脱水酶，以丙烯醛脱氢酶、磷酸转乙酰酶和丙酸激酶替代醛脱氢酶，从而解决了旧合成途径产量低的瓶颈，使3-羟基丙酸产率提高到40％，但迄今为止仍然未见产业化报道。Cargill公司在专利中设计了3条从葡萄糖经丙酮酸发酵生产3-羟基丙酸的途径，包括乳酸途径、乙酰辅酶A途径和β-丙氨酸途径，且实验室实验证明这些过程的可行性，但目标基因在细胞内稳定性、酶的表达水平及活性、宿主细胞对的耐受性以及产物的输出和收集等都成为其实际应用中的挑战。因此，本领域需要一种优化的培养基以及调控方法，并对发酵过程进行调控，以提高微生物发酵生产3-羟基丙酸的效率。

发明内容

针对现有3-羟基丙酸生物制备方法的不足，本发明的目的在于提供一种皱褶假丝酵母发酵生产3-羟基丙酸的方法。

为实现上述目的，本发明提供的发酵生产3-羟基丙酸的方法，其步骤如下：

A)采用常规的方法培养皱褶假丝酵母：

B)将步骤A的皱褶假丝酵母种子液以培养基体积4-7％的接种量接种，搅拌，pH控制在5.3±0.2，在25-40℃下发酵培养10-20小时；培养基的组分和重量含量为：

蔗糖1-12％、酵母粉0.1-0.5％、蛋白胨0.5-2.0％、丙酸钠0-0.5％、硫酸镁0.01-0.1％、磷酸二氢钾0.01-0.1％、硫酸铁0.001-0.004％；

C)加入丙酸钠，其加入量为培养基重量的0.1-1.0％，pH控制在4.7±0.2，在25-40℃下发酵培养15-30小时；

D)将pH控制在4.2±0.2，在25-40℃下发酵培养20-40小时，得到含有3-羟基丙酸的发酵培养液。

所述的方法，其中，步骤B中的搅拌速度控制为200-300rpm。

所述的方法，其中，以NaOH或HCl溶液调节pH值。

所述的方法，其中，步骤D中通过补充蔗糖水溶液使发酵培养液中的蔗糖浓度维持在4-10gL^-1。