[发明专利]一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种全基因组的改造方法，特别是涉及一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法。

背景技术

高浓度乙醇是酵母乙醇发酵后期发酵缓慢乃至终止和发酵终点残糖高的主要因素，筛选耐高浓度乙醇的酵母菌株是提高酿酒酵母乙醇发酵性能的重要策略之一。同时，酵母的大多数与发酵相关的特性都是由多基因控制的，对这些基因了解的很少而且它们广泛的分布在整个基因组中。目前，虽然基因组重排技术已经成功的应用到了原核生物中，但是真核生物的复杂性使基因组重排技术还没有应用到酵母研究中。例如，酵母具有较厚细胞壁(100～200nm)，而且酵母的融合是由MAT等位基因控制的复杂过程等等，这些因素导致在酵母中不能直接应用原生质体融合的方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法，包括如下步骤：(1)用甲基磺酸乙酯对酿酒酵母双倍体菌株进行随机诱变，使待处理菌液中所述甲基磺酸乙酯的体积终浓度为2％-4％，所述酿酒酵母双倍体菌株的浓度为2×10⁶～6×10⁶个细胞/ml；(2)通过高效产孢、孢子纯化和充分融合的3-5轮有性重组，使文库中菌株间发生基因组重排，构建酿酒酵母乙醇高产菌株。

所述甲基磺酸乙酯的体积终浓度最好为3％。

所述酿酒酵母双倍体菌株的浓度为3×10⁶～5×10⁶个细胞/ml；

所述有性重组的轮数为4。

本发明的一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法，所构建的重组菌株乙醇产量较对照菌株提高了8.88％，残糖降低了64.37％，发酵周期缩短了10小时，乙醇及高渗透压抗性是对照菌株的5.10倍，为燃料乙醇工业生产提供了优良的菌株。

附图说明

图1为不同甲基磺酸乙酯浓度下酵母菌株的生长状况；

图2为不同甲基磺酸乙酯浓度下酵母菌株的糖耗情况；

图3为重组菌株在初糖浓度为30％时生长状况；

图4为重组菌株在初糖浓度为30％时耗糖情况；

图5为重组菌株在初糖浓度为30％时乙醇产量；

图6为重组菌株在初糖浓度为30％发酵终点时活菌浓度；

图7为本发明的原理示意图。

具体实施方式

本发明所使用的酿酒酵母双倍体菌株是可以采用任何来源的酿酒酵母双倍体菌株。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法，以实验室酿酒酵母双倍体菌株W303(本实验室保藏)为出发菌株，构建乙醇产量高、遗传稳定、发酵周期短等具有优良发酵性状的非整倍体酵母菌株。

实施例2

一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法，以工业酿酒酵母双倍体菌株(购于安琪酵母有限公司)为出发菌株构建发酵速率快、葡萄糖-醇转化率高、遗传稳定性高、乙醇终产量高和残糖低的非整倍体酵母菌株。

步骤如下：

1材料与方法

1.1材料

实验菌株：酿酒酵母双倍体菌株(商品化的安琪酵母)(简称酵母)

培养基：YPD，玉米面发酵培养基

1.2方法

1.2.1酵母用甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulphonate，EMS)诱变处理

[1]将酵母细胞接入YPD液体培养基中，于30℃下振荡培养过夜；

[2]测定细胞浓度使之处于对数生长期，收集大约1×10⁸个细胞于四个15ml塑料试管中，其中一个为对照。用pH值为7.0磷酸钠缓冲液(0.1mol/L)洗涤两次，最后用8ml的此缓冲液重悬；

[3]将上述细胞转移到玻璃试管中，分别加入不同剂量的EMS，对照不加。然后放入30℃摇床中，培养1h；(不同剂量是指：使待处理菌液中EMS的体积终浓度为0，2％，3％，4％)

[4]向各试管中加入等量的5％无菌的硫代硫酸钠失活EMS的突变作用；

[5]收集突变后的细胞，用5％无菌硫代硫酸钠洗两次，再用无菌水洗一次，用无菌水将其稀释到一定的浓度涂布在固体YPD平板上，将其放入30℃培养箱中培养；

[6]待平板上长出菌落后，计算EMS的细胞致死率，其中致死率介于50％～90％的诱变剂量为最佳诱变剂量范围。

[7]使用最佳的诱变剂量，对双倍体细胞进行EMS诱变。将诱变后的细胞接种到发酵培养基中进行发酵实验。