[发明专利]运用复合荧光PCR技术检测食源性致病肠杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细菌检验技术，具体地说是运用荧光PCR反应来检测致病细菌，特别是食源性致病肠杆菌的技术。

背景技术

食品中常见的致病菌是引起食物中毒的主要原因之一，可导致多种疾病发生，严重威胁着人们的健康，食品中常见的致病菌主要是肠杆菌。快速、准确的检测食品中的致病菌是有效预防和控制病原菌感染的前提条件。随着分子生物学的发展，食品检验检疫工作中的细菌鉴定方法已经从传统的简单生化实验水平上向分子生物学的方法如PCR、探针杂交等技术发展，但是分子生物学的检测方法在短期内仍然难以代替传统的生化鉴定，目前分子生物学方法主要用于大量样品的初筛。需要检测的食源性肠杆菌主要包括以下几种：志贺氏菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、出血性大肠杆菌和大肠杆菌O157:H7等。

发明内容

针对上述目标菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种运用复合荧光PCR技术快速低成本的检测志贺氏菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、出血性大肠杆菌和大肠杆菌O157:H7方法。

该方法包括：应用该方法检测食源性病原微生物的所使用的引物组和与之配套的PCR反应条件。其中引物、探针的全部序列如下：

引物：

引物序列一：5’CCGTGTACGCTTAGTCGCTTAACCTC

引物序列二：5’TCTTTAAGAATCTGGATCAAGCTGAAA

引物序列三：5’CGAATGTGTCACCACATTCTCACCT

引物序列四：5’GGTAAAGAGGTTCTGACTACACGATG

引物序列五：5’CCCCATCGTGTAGTCAGAACCTCT

引物序列六：5’ATTTGAAGAGGTTTTAACTACATGTTAT

引物序列七：5’ATAACATGTAGTTAAAACCTCTTCAAAT

引物序列八：5’TGAACAGGAGGTTTCTGCGTTAG

引物序列九：5’ATATGTCAACCTCTGACTGATAGTCTGA

引物序列十：5’CTTTATGAAAGCCTGCGAGTAAAG

引物序列十一：5’CTGTTATGCTGGCTATCAGTCCTCT

本发明提供了更加快速和低成本通过荧光PCR方法检测食源性致病肠杆菌的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)设计特异性寡核苷酸引物用于荧光染料嵌合荧光PCR技术检测；

(2)整合各引物使之不相互干扰。

(3)以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增；

(4)扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量并在PCR反应结束后进行所合成DNA片段的熔解曲线的测定，并将数据传输至电脑通过配套软件进行分析可以观察到各种病原微生物的特异性熔解曲线的峰值。

本发明的体系1用特异性的引物组扩增沙门氏菌、志贺氏菌、小肠耶尔森氏菌的基因组均产生荧光信号，并生成相应的熔解曲线峰值，均未发现假阳性和假阴性的结果。

本发明中荧光PCR反应体系中各组分构成比例如下：

成分                      浓度       加样量

PCR体系预混合物           2倍        12.5μL

荧光嵌合法所用引物序列一：10μmol/L  0.3μL

荧光嵌合法所用引物序列二：10μmol/L  0.3μL

荧光嵌合法所用引物序列三：10μmol/L  0.6μL

荧光嵌合法所用引物序列四：10μmol/L  0.3μL

荧光嵌合法所用引物序列五：10μmol/L  0.3μL

荧光嵌合法所用引物序列六：10μmol/L  0.6μL

荧光嵌合法所用引物序列七：10μmol/L  0.6μL

DNA样品                              1μL

双蒸水                               8.5μL

总体积                               25μL

荧光PCR扩增程序及测定扩增片段的熔解温度程序为：

(1)95℃  10分钟；

(2)95℃  15秒；

(3)60℃  30秒；

(4)回到第(2)步，重复40次；

(5)95℃  2分；