[发明专利]米曲霉高效制备EGCG水解酶及生产EGC和没食子酸的方法

说明书

技术领域

本发明属酶的制备及酶的催化转化领域，特别是涉及一种EGCG水解酶的诱导制备及用该酶生产EGC和没食子酸的方法。

背景技术

茶儿茶素是茶叶中主要的生理活性成分，茶儿茶素由表没食子儿茶素没食子酸酯(epi-gallocatechin-3-gallate，EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin-3-gallate，ECG)、没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechin-3-gallate，GCG)、表儿茶素(epicatechin，又名cis-catechin，EC)、表没食子儿茶素(epigallocatechin，又名cis-gallocatechin，EGC)等组成。儿茶素单体在抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、抗突变、抗衰老、抗病毒、抗过敏、抗菌消炎、增强免疫功能、抗辐射、降血压、降血脂等方面均具有很高的活性，对预防和治疗恶性肿瘤、高血脂症、动脉硬化、脑血栓、糖尿病、肥胖病等均有良好作用。

不同的茶儿茶素单体的生理活性有一定的差异，分离制备各种单体能充分利用各种儿茶素具优势的生理活性。另外，开发茶儿茶素新药也要求单体的茶儿茶素。因而，分离纯化或者定向合成儿茶素单体，对扩大儿茶素的应用途径和方式，为儿茶素在医药、保健、食品、化妆品等工业上开拓新市场具有十分重要的意义。

目前已有的获得儿茶素单体的方法一般通过分离纯化的技术方法。而就EGC而言，在茶叶中含量较低，即使分离纯化收率较高，产量仍然很低，导致异常短缺而价格昂贵。因此，寻找一种能从那些量大且易得的原料生产EGC的方法就显得十分迫切和必要。EGCG是儿茶素中含量最高的组分，是EGC和没食子酸形成的酯，因此如能通过水解反应将EGCG水解成EGC和没食子酸就可以达到上述目的，具有现实意义。但常规的酸或碱水解等化学方法，存在水解率极低，水解产物极不稳定或反应过程中极易被氧化等缺点。另外，据文献报道，猪肝酯酶不能水解EGCG，也未发现其它市售酯酶或脂肪酶能水解EGCG。只有单宁酶(Tannase)可水解EGCG成非酯型儿茶素EGC，但是该酶产量少且价格高。

米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种好气性、易培养、产多种复合酶的真菌，属于半知菌亚门、曲霉属。米曲霉能分泌多种水解酶，如蛋白酶、淀粉酶和酯酶等。米曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点，已愈来愈受到人们的重视，在工业上具有重要作用。米曲霉在发酵生产酱油、制酱、酿酒等工业上的应用历史悠久。1987年，联合国粮食及农业组织(FAO)/世界卫生组织(WHO)/食品添加剂与污染物联合专家委员会(JECFA)批准米曲霉可用于食品工业用酶制剂的生产。美国环境保护局对米曲霉对人类健康和环境的危害和工业应用的风险性评价结果表明，米曲霉对动植物无致病性。米曲霉发酵所加工的产品及食品对人类或动物具有一定的保健功效，所以，利用米曲霉研发高质量的生物产品有着广阔的发展前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于将茶叶中含量丰富的EGCG转化成含量较少且价格昂贵的EGC的酶水解方法，该方法操作简单、转化率高、产物稳定、环保，可以为工业化大规模生产EGC单体和没食子酸提供新的思路和途径。

本发明的一种高效诱导米曲霉制备EGCG水解酶方法，包括下列步骤：

(1)将米曲霉种子培养基在25-30℃,100-250r/min条件下培养36小时；

(2)以4-10％接种量转接至含EGCG的发酵培养基中，在25-30℃,100-250r/min条件下培养48-120小时，过滤，离心得酶液。

所述的米曲霉是食品工业用安全菌种；

所述的EGCG原料采用不同的纯度；

所述的培养产酶过程是间歇式的、分批补料式或连续培养式。

本发明的一种利用EGCG水解酶生产EGC和没食子酸的方法，包括下列步骤：

(1)构建EGCG酶水解反应体系、酶液空白体系和底物空白体系；

(2)反应体系和空白体系在25-60℃，反应0-48小时或直至水解反应结束才停止；

(3)利用高效液相色谱和薄层层析分析底物和产物。

所述的EGCG酶水解反应体系是指EGCG底物、EGCG水解酶和pH3-7缓冲液体系；

所述的酶液空白体系是指EGCG水解酶和pH3-7缓冲液体系；

所述的底物空白体系是指EGCG底物和pH3-7缓冲液体系；

所述的EGCG底物采用不同的纯度；

所述的TLC分析是正相硅胶板分析或反相硅胶板分析。