[发明专利]香菇申香93菌种的分子特异标记及方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种香菇申香93菌种的分子特异标记及其获得方法与应用。

背景技术

我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2005年的242万吨，占全球香菇总产量的70％以上，改写了世界食用菌产量的排行榜，并不断缩小与排行第一的双孢蘑菇产量差距，有专家预测，由于中国香菇产业的迅猛发展，在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度，优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目，中国香菇已风靡世界。

优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言，香菇栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国香菇的快速发展；而且，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对香菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。

随着分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记和基因标记技术的建立与成熟，为发展简便、快速、准确的菌株鉴定技术提供了有效手段。SCAR(Sequence CharacterizedAmplified Region)标记是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点，本发明建立了香菇申香93菌种的SCAR分子标记，能对香菇申香93菌种进行快速鉴定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能应用于香菇申香93菌种快速鉴定和检测的分子特异标记及其获得方法。

一种香菇申香93菌种的分子特异标记为540bp大小的特异片段，其特异性PCR扩增引物对序列为：5’TCTGTTGCTCCTATTGC 3’和5’CCTTCAGCTAACCCAAA 3’。

一种香菇申香93菌种的分子特异标记的获得方法，包括下列步骤：

a.菌丝培养和基因组DNA的提取

将低温保藏的香菇菌种转接到PDA斜面上，25℃培养活化，收集菌丝，用改进的CTAB法提取基因组DNA。

b.香菇申香93菌株的特异DNA片断的获得

采用PCR技术，经过大量的筛选试验，采用随机引物(引物序列：TGCGCCCTTC)获得了香菇菌株申香93的特异DNA片断，分子量为553bp，将该片段克隆测序。

c.特异PCR扩增引物的获得

以得到的DNA序列为基础，设计特异PCR扩增引物，引物对的序列如下：5’TCTGTTGCTCCTATTGC 3’和5’CCTTCAGCTAACCCAAA 3’

d.用特异PCR扩增引物对对香菇申香93菌株进行SCAR-PCR扩增

为了排除其它菌种的假阴性情况，在SCAR-PCR反应体系中加入ITS(InternalTranscribed Spacer)通用引物对(ITS1、ITS4)，验证所有模板DNA的完整性。

e.电泳检测

电泳检测可见香菇申香93菌株能扩增出540bp大小的特异片断(图1)。

根据采用这一对特殊引物进行PCR扩增，以能否产生540bpDNA片段作为对香菇申香93菌株进行鉴定和检测的依据。

该检测方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点。该检测所需时间只需要2-3天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间；该方法在所收集的我国164个香菇生产菌株中具有香菇申香93的专一性。

附图说明

图1 SCAR-PCR扩增结果

9为香菇申香93菌株(上海市农业科学院食用菌研究所)，箭头所示为香菇申香93菌株扩增出分子量约为540bp的特殊DNA条带，其余编号为其它香菇菌株，均未见特异条带。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1