[发明专利]香菇申香93菌种的分子特异标记及方法与应用

权利要求书

1.一种香菇申香93菌种的分子特异标记，其特征在于：特异性PCR扩增引物对序列为5’TCTGTTGCTCCTATTGC 3’和5’CCTTCAGCTAACCCAAA 3’；DNA片断大小为540bp。

2.一种香菇申香93菌种的分子特异标记的获得方法，其特征在于：包括如下步骤：

a.菌丝培养和基因组DNA的提取

将低温保藏的香菇菌种转接到PDA斜面上，25℃培养活化，收集菌丝，用改进的CTAB法提取基因组DNA；

b.香菇申香93菌株的特异DNA片断的获得

采用PCR技术，经过大量的筛选试验，在在采用随机引物获得了香菇菌株申香93的特异DNA片断，分子量为553bp，将该片段克隆测序；

c.特异PCR扩增引物的获得

以得到的DNA序列为基础，设计特异PCR扩增引物，引物对的序列如下：5’TCTGTTGCTCCTATTGC 3’和5’CCTTCAGCTAACCCAAA 3’；

d.用特异PCR扩增引物对对香菇申香93菌株菌株进行SCAR-PCR扩增

为了排除其它菌种的假阴性情况，在SCAR-PCR反应体系中加入ITS(InternalTranscribed Spacer)通用引物对(ITS1、ITS4)，验证所有模板DNA的完整性；

e.电泳检测

电泳检测可见香菇申香93菌株能扩增出540bp大小的特异片断。

3.如权利要求2所述的一种香菇申香93菌种的分子标记的获得方法，其特征在于：步骤

b所用随机引物序列为：TGCGCCCTTC。

4.如权利要求2所述的一种香菇申香93菌种的分子标记的获得方法，其特征在于：步骤a中菌丝培养条件为将低温保藏的香菇菌种转接到PDA斜面上，25℃培养活化，两周后接到100mL PD液体培养基中，25℃100r/min振荡培养两周；所提取DNA稀释至20ng/μL。

5.如权利要求2所述的一种香菇申香93菌种的分子特异标记的获得方法，其特征在于：所述步骤d中的SCAR-PCR扩增：扩增体系总体积为：25μL，扩增体系：10×PCR buffer2.5μL，25mmol/L MgCL₂ 2μL，10mmol/L dNTP 0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L香菇申香93菌株检测专用引物对各1μL，模板DNA 1μL(浓度1ng～10ng/μL)，ddH₂O 18.6μL，PCR反应条件：94℃ 1min；94℃ 15second，61℃ 15second，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min。

6.如权利要求2所述的一种香菇申香93菌种的分子特异标记的获得方法，其特征在于：所述步骤e电泳检测为：取步骤d PCR扩增产物8μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5％的琼醋糖凝胶上，于0.5 X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。

7.一种香菇申香93菌种的分子特异标记应用于香菇申香93菌种的快速鉴定和检测。