[发明专利]融合骨唾液酸蛋白的酵母表达载体、纯化方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和微生物发酵工程技术领域。

背景技术

骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein，简称BSP)是细胞外基质中的一种酸性糖蛋白，其组织分布具有局限性，分布在矿化组织，包括骨、牙齿和钙化的软骨等，主要由成骨细胞、破骨细胞以及软骨细胞表达和分泌。骨唾液酸蛋白参与组织矿化，与多种骨代谢性疾病有关，近年来又发现BSP与肿瘤的骨转移、动脉粥样硬化及血管增生有关。为了深入研究BSP的生物活性，必须获得稳定的BSP。可从动物或人骨中提取BSP，但来源有限，且提纯的方法繁琐，因此，利用基因工程技术表达重组BSP对于研究BSP的结构与功能有重要意义。

目前在原核表达系统中要表达全长BSP还存在问题，只能得到一些具有空间折叠的未修饰的BSP片段，功能也比天然BSP分子要弱。在真核细胞中已经表达出全长BSP，但是，除了本申请人，应用酵母表达系统来表达rBSP还未见报道。本发明所选用的巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)属甲醇营养型酵母，具有操作简便、高表达、高稳定、高分泌、具有翻译后加工修饰系统等优点，因此一些蛋白在细菌、啤酒酵母或者杆状病毒中不能有效表达，而在毕赤酵母中却能以活性形式成功表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一种融合骨唾液酸蛋白的酵母表达载体，并且易于大规模、高效、快速生产，成本低廉，为研究BSP的结构和功能提供材料。

本发明的另一目在于提供一种融合骨唾液酸蛋白的纯化方法及其应用。

本发明提供的一种融合骨唾液酸蛋白的酵母表达载体pPICZaA-hbsp，通过以下步骤获得：

1)根据GenBank中人骨唾液酸蛋白基因(hbsp)序列设计基因特异性引物：

上游引物：5’-AGGAATTCGACTGCCAGAGGAAGCAATCAC-3’

下游引物：5’-CGGAATTCACTGGTGGTGGTAGTAATTCTG-3’

以骨唾液酸蛋白(BSP)基因为模板，应用RT-PCR技术从人股骨外膜组织的总RNA中扩增出BSP的cDNA，克隆至pBluescript II RI质粒中，构建重组质粒pB-hbsp；

2)根据毕赤酵母分泌型表达质粒pPICZaA及hbsp序列设计PCR设计引物：

上游引物：5’-CCGCTCGAGAAAAGATTCTCAATGAAAAA-3’

下游引物：5’-GCTCTAGATAATCATCATCATCTTTCTGGTGGTGGTAGTAA-3’

以重组质粒pB-hbsp为模板进行PCR扩增，PCR产物与毕赤酵母表达载体pPICZaA重组，构建分泌型融合表达rhBSP-His6的质粒pPICZaA-hbsp。

本发明提供的一种融合骨唾液酸蛋白的纯化方法是：将融合表达载体pPICZaA-hbsp线性化后电转化酵母菌GS115，通过甲醇诱导表达，获得融合蛋白rhBSP-His6，应用固定化金属离子亲和层析法进行纯化，目的蛋白达到电泳纯。

本发明提供的融合骨唾液酸蛋白可应用在制备单克隆及多克隆抗体中，为深入研究BSP免疫学和生物学性质和探索其作为药物治疗靶点的可行性奠定基础。

本发明的技术方案细述如下：

1)根据GenBank中人骨唾液酸蛋白基因(hbsp)序列设计基因特异性引物，应用RT-PCR技术从人股骨外膜组织的总RNA中扩增出BSP的cDNA，克隆至pBluescript II RI质粒中，构建了重组质粒pB-hbsp，为BSP的表达研究打下基础。

2)根据毕赤酵母分泌型表达质粒pPICZaA及hbsp基因序列设计PCR引物，以重组质粒pB-hbsp为模板进行PCR扩增，PCR产物与质粒pPICZaA重组，构建了分泌型融合表达rhBSP-His6的质粒pPICZaA-hbsp；重组质粒pPICZaA-hbsp经电转化到毕赤酵母GS115宿主细胞中，通过对转化子的初筛和复筛，筛选出高效分泌表达rhBSP的毕赤酵母工程细胞GS115/pPICZaA-hbsp，检测结果表明，重组表达质粒已整合至宿主染色体上，表现为对甲醇敏感的MutS表型。