[发明专利]扩增多个识别用核酸序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸的扩增反应技术。

背景技术

人的SNP(单核苷酸多态性，Single Nucleotide Polymorphism，即1碱基多型)为以在数百个碱基中有1个左右的频率可见的基因多型。它们的变异无论是编码还是非编码均广泛地散布存在于基因组上。另外，其变异不仅是碱基的取代，还可见碱基的插入(嵌入)或缺失(欠缺)。人基因组的大小为30亿碱基对，因此即便以在1000个碱基中有1个的比例存在这种多型，整体上也存在有300万的SNP。因此，从这种庞大数量的SNP中发现医学上有用的是很困难的。例如，为了明确SNP与疾病或SNP与药剂敏感性等的相关性，通过检测尽量多的样品，可以高精度地将相关SNP进行特定。为此，首先要构成仅可以获得统计学上显著的结果的数量的病例组和对照组。接着，对各个组以必要的密度和数量来检测疑有相关性的SNP，然后确定这些SNP型，即进行分型(typing)。之后，必须进一步分析与疾病或药剂敏感性等的相关性。

桑格法(Sanger method，决定核酸构造法之一)为使用DNA测序仪进行分型的方法。进行测序时，也可确定SNP周围的碱基序列，也可知插入或缺失，但用于扩增SNP的某个基因的引物的设计却很困难，测序反应的试剂、装置也很昂贵。另外，在一次测序中可以分型的SNP的数量根据其平均间隔和能够测序的碱基长，平均为1处或2处左右。利用这样可靠性高的桑格法，一次研究的SNP的数量有限，且花费时间和成本。因此，在为了明确疾病与SNP的关系的研究中，不得不缩小成为对象的基因的范围而进行分型。

多重法(multiplex method)是作为SNP等基因的分析方法而在90年代后期被提出的方法。

例如，康奈尔大学(Cornell University)的Barany等人开发出了下述方法：通过将成为LDR(即连接酶检测反应，ligase detection reaction)的使用了连接酶的SNP检测方法和将目标核酸序列转换成称为邮编(zip-code)的标签(tag)的手段进行组合，从而在同一反应液中检测多个SNP。该方法目前作为ABI公司的检测试剂盒SNPlex而商品化(日本特表2000-511060号公报、日本特表2001-519648号公报、日本特表2004-526402号公报)。

Orchid Cellmark公司提供了下述称为SNP-IT的方法：在1个反应液中进行检测反应，并利用配置于微孔板底部的微阵列来区分48种阵列(日本专利第3175110号说明书、日本特表2002-508664号公报)。

目前认为最成功的是Illumina公司提供的方法。该方法在进行聚合酶延长反应和连接酶的连接反应来检测SNP后，将目标核酸序列转换为邮编序列，通过使用与微阵列相同系统的独自的检测设备(称为微珠阵列，BeadArray)，从而同时检测最多约为1500种的邮编序列(日本特表2002-519637号公报、日本特表2003-521252号公报)。

TM Bioscience公司提供了利用用Luminex公司的荧光而分色过的微珠来进行检测的多重反应试剂盒(日本特表2004-522440号公报、日本特表2004-526433号公报)。其作为研究用途的遗传病检测试剂盒被提供。

Parallele公司提供了MIP(分子倒置探针，molecular inversion probe)法。其提供了利用开环探针和间隙连接反应(gap ligation)法，并使用降低探针合成成本、提高反应效率的标签所进行的多重分型法(Hardenbol，P.etal.，Nat.Biotechnol.21，673-678(2003)、Hardenbol，P.et al.，Genome Res.15，269-675(2005))。

上述多重技术中，一般来说，按照在标签两侧使通用引物相邻的方式或者介由其它序列来挟持标签的方式来配置通用引物序列而构成。利用这种标签的多重法(以下也称为标签多重法)作为用于分析SNP的有效手段而提出。