[发明专利]核酸扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因分析，尤其是涉及基因组分析，具体地说，本发明涉及一种核酸(或目的核苷酸序列)的扩增方法，该方法通常被用于测序，尤其是基因组的测序中。

背景技术

DNA自动序列分析方法的发展及生物信息学的发展，给生物学和医学带来了革新，并将其引入到基因组学新领域——基因和基因组的研究。这些技术被用于破译许多细菌(5，7，9，10，20)，古细菌(3)及真核生物的全基因组(6，11)。

较大基因(包括人类基因组)的传统测序方法是采用一种三阶段各个击破“divide-and-conquer”战略(29)。

第一阶段是构建被研究若干生物体的DNA克隆库，先随机将DNA切割成为片断，再按片断的大小不同将它们分类，然后将片断插入到合适的载体中，这些载体具有在酵母或细菌宿主中增殖的能力。

第二阶段包括：(a)在重叠的酵母或细菌人工染色体(YAC或BAC)克隆上，通过识别共有的染色体界标，构建一个低分辨率的物理图谱。举例说，这些界标可能是能被多聚酶链反应(PCR)扩增的唯一位点(序列标志位点即STSs)，或限制性内切酶酶切消化位点；(b)通过随机将YAC或BAC亚克隆到粘粒载体，并识别它们的界标、重叠序列，构建(已知序列的)高分辨率图谱。

第三阶段即最后阶段：选择一套重叠度最小的粘粒克隆，随机切割成小片段，将其亚克隆到M13噬菌体或质粒载体中。在每一个粘粒中，可测得约800个M13噬菌体克隆，并将其组装构成40kbp的粘粒插入片段。这种随机方法(即鸟枪法)的测序结果冗余度极高，约为实际核苷酸量的八倍。

由于“divide-and-conquer”方法的复杂且价格昂贵，人们开始研究发展一些新方法。基因组研究所(TIGR)首先创用大碱基(Mbp)基因组的直接鸟枪测序法。在这种方法中，染色体DNA的小片段被直接克隆到M13载体中。克隆被随机排列并直接组装成染色体序列。这个全基因随机测序技术被用于许多细菌和古细菌的基因测序，包括流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(9)的1.9Mbp基因组。生殖支原体(Mycoplasmagenitalium)(10)的0.58Mbp基因组，和詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(3)的1.66Mbp基因组。这一方法不需要任何现有的物理图谱，能显著减少完成测序所需的每一碱基对成本。然而，同所有的随机测序方法一样，其根本问题是需要有一个较高的序列冗余度。换句话说，在毗连序列群(sequence contigs)即序列对比群(clusters of alignedsequence)构建之前，用计算机排序方法测得每个核苷酸的量是核苷酸本身的许多倍。例如，H.influenzac基因组用原始的鸟枪法组装，除需要生成11.6Mbp随机序列外(大于基因组总量的6倍)，还包含140个需要大量人工填补的重叠群缺口(9)。

对随机鸟枪测序法的固有的低效性的一种替代方法是引物步进法(primer walking)(25)。在这个过程中，利用根据已知序列设计的一个引物，将序列信息延伸到未知的旁侧序列区域。这个新序列信息可用来设计下一个引物。这个过程不断继续，直到确定了目的区域的全部序列。尽管引物步进法对于大规模测序项目似乎很具有吸引力，但费时较长，且每隔400—500碱基要合成单个引物，其代价是昂贵的，因此这个方法实际上行不通。利用一个合成前的短引物库，可不需要合成每一个新引物。可惜，库中相关短引物的数量极大，例如，一个完整八聚体库包含有65,536个引物，一个完整十聚体库含有上百万个单引物。

有两个基本解决方法可使引物步进法可行，并不需要合成较大引物库。第一个方法是，选用有用的八聚体、九聚体或十聚体的最优化小组，来缩小引物库(4、12、24、26)。第二个方法是采用连接6单体的序贯引物延伸方法(SPEL-6)，将至少三个邻近的互补六聚体(即从全套的4096个六聚体或1024个单一变性六聚体中提取出来)退火到单链DNA模板上，组装成大引物(18bp或更长)。退火六聚体通过连接反应连接，进行一个标准测序反应(15—19、27)，以上述这个方法为基础，发展了一系列相关技术，包括利用六聚体但不需要连接反应(21、22)，或以自我互补的六聚体链(8)的连接反应为基础，