[发明专利]核酸扩增方法

权利要求书

1.一种目的核苷酸序列的扩增方法，其特征在于，所述核苷酸序列至少包括一个序列

已知区，所述序列已知区包含从5′端到3′端的两个非常邻近的第一已知区和第二

已知区，所述方法包括：1)第一步扩增至少包含(a)以一个至少包含所述目的核苷酸序列的序列作为模板；和(b)第一引物具有从5′端到3′端的：一个5′标志序列；一个与第一已知区相应的变性序

列；和一个所述目的核苷酸第二已知区的互补序列；所述扩增步骤产生第一个扩增产物；2)第二步扩增至少包含(a)以所述第一个扩增产物作为模板；和(b)第二引物具有从5′端到3′端的：一个所述第一引物5′标志序列的互补链的杂交序

列，和一个目的核苷酸序列第一已知区的互补序列；所述第二步扩增产生第二个扩增产物。

2.一种目的核苷酸序列的扩增和测序方法，包含如权利要求1所述的方法进行目的核苷酸序列扩增和对第二个扩增产物进行测序。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述扩增步骤是聚合酶链式反应。

4.如权利要求1-3之一所述的方法，其中，分别在第一引物和第二引物中，所述5′标志

  序列与所述第一引物5′标志序列的互补链的杂交序列是相同的。

5.如权利要求1至4中的任一权利要求所述的方法，其中，所述5′标志序列是个载体特

  异性序列。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述5′标志序列来自M13噬菌体，pUC18，pBR322，

  pGEM.BLUESCRIPT或pBELOBACII。

7.如权利要求1至6中的任一权利要求所述的方法，其中，所述5′标志序列的长度是10—25

  个碱基。

8.如权利要求1至7中的任一权利要求所述的方法，其中，所述5′标志序列的长度是15—18个碱基。

9.如权利要求1至8中的任一权利要求所述的方法，其中，所述5′标志序列的长度是15个碱基。

10.如权利要求1至9中的任一权利要求所述的方法，其中，在所述第一引物中，所述第二已知区的互补序列的长度是4—8个碱基。

11.如权利要求1至10中的任一权利要求所述的方法，其中，在所述第一引物中，所述第二已知区的互补序列的长度是6个碱基。

12.如权利要求1至11中的任一权利要求所述的方法，其中，在所述第一引物中，与所述目的核苷酸第二已知区的互补序列相随的变性序列的长度是6—12个碱基。

13.如权利要求1至12中的任一权利要求所述的方法，其中，在所述第一引物中，与所述目的核苷酸的第二已知区的互补序列相随的变性序列的长度是9个碱基。

14.如权利要求1至13中的任一权利要求所述的方法，其中，在所述第二引物中，所述目的核苷酸第一已知区的互补序列的长度是1—5个碱基。

15.如权利要求1至14中的任一权利要求所述的方法，其中，在所述第二引物中，所述目的核苷酸第一已知区的互补序列的长度是3个碱基。

16.如权利要求2至15中的任一权利要求所述的方法，其中，所述5′标志序列，或所述5′标志序列互补链的杂交序列被用作测序引物。

17.如权利要求2至16中的任一权利要求所述的方法，其中，所述第二引物被用作测序引物。

18.如权利要求1至17中的任一权利要求所述的方法，其中，所述第一步扩增和第二步扩增分别包括两个第一引物和两个第二引物；所述第一引物之一在第一步扩增反应中作为反向引物，所述第二引物之一在第二步扩增反应中作为反向引物。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述5′标志序列在每个第一引物上是不相同的。

20.如权利要求1至19中的任一权利要求所述的方法，其中，所述第一步扩增反应与第二步扩增反应是同时进行。

21.一种如权利要求1至20中的任一权利所述的方法得到的产物。