[发明专利]猪单精子微卫星DNA标记分型方法

说明书

本发明属于动物微卫星DNA标记分型技术领域，具体涉及猪的单精子DNA标记分型技术领域。

鉴别单个精子中的基因型，对于性别鉴定和控制，遗传疾病的诊断，高精度遗传作图等方面均具有重要的应用价值。但由于技术难度大，除了人类中有少量报道外，家畜中的报道仅限于牛。Lewin等(1992，Genomics，13：44-48)研究了牛23号染色体上淋巴细胞抗原(BoLA)DRB₃基因与促乳素(PRL)基因间的重组率，他们分析了一个双杂合子牛的300个精子，最大似然法的估计结果为0.04，二者的紧密连锁说明可选择到同时含抗病力强且产奶量高的等位基因个体；Lie等(1993，Anim.Biotech，5：33-45)分析了3个酪蛋白(CASAS1、CASB、CASK)基因之间的遗传图距并作了排序，他们分析了一个三杂合子牛的330个精子，发现CASAS1与CASB、CASAS1与CASK间的重组率均为0.0075。且研究的均为功能基因。

单配子中的微卫星DNA分型的报道3篇仅限于人类(Crouau-Roy等，1992，Mol.and Cell Bio.，3：239-242；Hubert等，1992，Am.J. Hum.Genet.，51：985-991；Furlong等，1993，Am.J.Hum.Genet.，52：1191-1199)，且都依赖于价值昂贵的流式细胞分离仪进行单精子的分离工作，均是基于同位素扩增，通过放射自显影辨别单精子单倍型，且需时长，不安全。猪中尚未建立单精子分型技术。

目前已发表的单精子分型技术用于微卫星研究的三篇报道仅限于人遗传作图(Crouau-Roy等，1992；Hubert等，1992；Furlong等，1993)，而且所采用的方法均为两轮PCR，并在第二轮中加入同位素扩增，放射自显影鉴别等位基因，该法需时长且不安全。

本发明的目的在于克服已有技术的不足，建立一种猪单精子微卫星DNA标记分型方法，以达到简便、快速、安全和经济有效的鉴别猪单精子基因型的效果。

本发明通过以下技术方案实现：

一种猪微卫星DNA标记分型方法，含有猪微卫星位点引物，其步骤包括PCR(聚合酶链式反应，下同)和等位基因检测，其特征在于，对每个位点设计一个半嵌套引物，所述的步骤包括收集猪精液，分离单精子，选择检测位点，引物及内嵌引物的设计，单精子裂解，PCR扩增，等位基因检测，所述的PCR为三轮，按照以下步骤操作：

1)采用琼脂糖电泳法分离猪的单个精子，在小离心管中直接裂解：

2)第一轮PCR使步骤1)所述的单精子DNA拷贝数大量增加，使其适合于对多个位点的检测和分型；

3)第二轮PCR对所涉及的特定目的位点进行扩增，获得大量目的微卫星DNA片段；

4)第三轮PCR采用所述的内嵌引物，对目的位点的基因型进行分型；

5)采用聚丙酰胺凝胶电泳和银染方法对步骤4)所述的基因型进行分析和鉴别。

本发明采取以下步骤分离单精子：

取洗涤后的精液2μl悬浮于1ml PBS中，再从中取2μl加入到20ml 0.7％低溶点琼脂糖溶液中，混匀后铺于玻片上，37℃烘烤1h后，在倒置显微镜下，将只含有单个精子的琼脂糖碎片挑起，放入0.2ml Ep管中备用。

本发明采取以下步骤对单精子进行裂解：

向每个含有单个精子的反应管中加入5μl单精子裂解液，覆盖矿物油后，65℃保温30min；再加入5μl单精子中和液，离心，混匀后，-20℃保存备用。

本发明采取以下步骤对单个精子进行PCR扩增：

1)所述的PEP反应体系为：500μl 10×不含K⁺的Buffer；含15个碱基的500μl 400mM随机引物，250μl 2mM 4种dNTP混合液，100μl 5U/μl Taq DNA聚合酶，补H₂O至4.0ml，将上述混合液用于100个反应之用；

2)向每个已裂解的单精子Ep管中加入40μl PEP反应液，混匀，覆盖矿物油后放入PCR仪中扩增，扩增条件为：95℃，5min→50×(37℃，2min→55℃，4min→92℃，1min)→72℃，5 min。其中从37℃→55℃的升温速度为10S/℃，扩增完毕后，4℃保存备用；

3)两轮PCR扩增步骤为：