[发明专利]猪单精子微卫星DNA标记分型方法

权利要求书

1、一种猪微卫星DNA标记分型方法，含有猪微卫星位点引物，其步骤包括PCR和等位基因检测，其特征在于，对每个位点设计一个半嵌套引物，所述的步骤包括收集猪精液，分离单精子，选择检测位点，引物及内嵌引物的设计，单精子裂解，PCR扩增，所述的PCR为三轮，按照以下步骤操作：

1)采用琼脂糖电泳法分离猪的单个精子，在小离心管中直接裂解：

2)第一轮PCR使步骤1)所述的单精子DNA拷贝数大量增加，使其适合于对多个位点的检测和分型；

3)第二轮PCR对所涉及的特定目的位点进行扩增，获得大量目的微卫星DNA片段；

4)第三轮PCR采用所述的内嵌引物，对目的位点的基因型进行分型；

5)采用聚丙酰胺凝胶电泳和银染方法对步骤4)所述的基因型进行分析和鉴别。

2、根据权利要求1所述一种猪微卫星DNA标记分型方法，其特征在于采取以下步骤分离单个精子：

取洗涤后的精液2μl悬浮于1mlPBS中，再从中取2μl加入到20ml0.7％低溶点琼脂糖溶液中，混匀后铺于玻片上，37℃烘烤1h后，在倒置显微镜下，将只含有单个精子的琼脂糖碎片挑起，放入0.2mlEp管中备用。

3、根据权利要求1所述一种猪微卫星DNA标记分型方法，其特征在于采取以下步骤对单个精子进行裂解：

向每个含有单个精子的反应管中加入5μl单精子裂解液，覆盖矿物油后，65℃保温30min；再加入5μl单精子中和液，离心，混匀后，-20℃保存备用。

4、根据权利要求1所述的猪微卫星DNA标记分型方法，其特征在于采取以下步骤对单个精子进行PCR扩增：

1)所述的PEP反应体系为：500μl 10×不含K⁺的Buffer；含15个碱基的500μl400mM随机引物，250μl2mM4种dNTP混合液，100μl 5U/μl Taq DNA聚合酶，补H₂O至4.0ml，将上述混合液用于100个反应之用；

2)向每个已裂解的单精子Ep管中加入40μl PEP反应液，混匀，覆盖矿物油后放入PCR仪中扩增，扩增条件为：95℃，5min→50×(37℃，2min→55℃，4min→92℃，1min)→72℃，5min。其中从37℃→55℃的升温速度为10S/℃，扩增完毕后，4℃保存备用；

3)两轮PCR扩增步骤为：

第一轮PCR，其反应体系为：500μl 10×PCRBuffer，250μl 2mM dNTP，10μl 100μM正向引物，10μl 100μM反向引物，20μl 5U/μl Taq DNA聚合酶，加H₂O至4.5ml，将上述混合液以每管45μl分装至100个0.2ml Ep管中，然后加5μl单精子PEP产物，覆盖矿物油，放入PCR仪中扩增，扩增条件为：96℃，5min→10×(94℃，1min→60℃，4min)→16×(94℃，1min→60℃，3min)→72℃，5min→扩增产物4℃保存备用；

第二轮PCR：其反应体系：500μl 10×PCR Buffer，250μl 2mM4种dNTP的混合液，45μl 100μM正向或反向引物，45μl 100μM内嵌引物，20μl 5U/μl TaqDNA聚合酶，加水至4.8ml将上述混合液以每管48μl分装至100个反应管中，每管加入2μl第一轮反应产物，覆盖矿物油后扩增，反应条件为：95℃，5min→23×(94℃，1min→60℃.1min)→72℃，5min。