本申请涉及质粒技术领域,尤其涉及一种穿梭质粒、构建方法及应用。该穿梭质粒以pEZ15Asp为基础质粒,对其进行改造,通过对其复制子进行替换后,该穿梭质粒具有如SEQID NO.26~29任一所示的核苷酸序列所示。该穿梭质粒可以在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭,第一复制起始区具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列,第二复制起始区具有SEQ IDNO.3~8任一所示的核苷酸序列。其电转入得到的运动发酵单胞菌转化子,在稳定传代30代后生长速率无显著下降,并可与内源性质粒长期兼容,说明穿梭质粒的传代稳定性强,十分适合于构建重组菌株,进行运动发酵单胞菌代谢工程及基因功能的研究和应用。