本发明公开了一种人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用,属于分子遗传学领域。本发明双荧光素酶报告基因载体为pGLTlr4/PSV40/3UTR,载体的DNA序列如SEQ ID NO.5所示;双荧光素酶报告基因载体包含人源TLR4基因3'非翻译区序列,人源TLR4基因3'非翻译区序列如SEQ ID NO:3所示,人源TLR4基因3'非翻译区序列克隆至双荧光素酶报告载体pGL3‑Promoter中luc基因下游。本发明人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体可用于检测TLR4基因3'非翻译区上SNP位点对TLR4基因表达的影响以及用于检测TLR4基因3'非翻译区上SNP位点与miRNA的靶向关系。