本发明属于生物技术领域，公开了一种适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板、体系及其用途。一种适于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板，所述线性DNA模板依次包括含有启动子的片段、限制性内切酶BsaI的编码基因和含有终止子的片段，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述线性DNA模板不含有限制性内切酶BsaI的酶切位点。本发明的线性DNA模板，能有效防止线性DNA模板被核酸酶降解，其能够适用于任意的体外无细胞蛋白体系且能顺利表达，采用本发明的线性DNA模板进行体外无细胞蛋白合成，获得的限制性内切酶BsaI的纯度高、比活高
本发明提供了一种突变型限制性内切酶BsaI及其制备方法和应用，所述突变型限制性内切酶BsaI具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有≥98％同源性的多肽；(III)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过1～20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有限制性内切酶的活性本发明通过对野生型限制性内切酶BsaI及进行多位点氨基酸突变，得到突变型限制性内切酶BsaI，所得酶稳定性好，酶活和纯度满足市场需要，且价格低廉。
