[发明专利]检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片

摘要

本发明公开了一种检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片，利用CRISPR‑Cas12a蛋白特异性切割双链DNA后所产生的对单链DNA切割的非特异性，通过单链荧光探针被Cas12a蛋白非特异性切割之后所产生荧光强弱变化，构建检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片。本发明利用疏水蛋白对芯片基底进行修饰，经过疏水蛋白修饰的芯片基底与普通基底相比，不仅使亲水蛋白Cas12a在芯片表面均匀铺展，还避免了蛋白和crRNA的浪费，保证目的基因在低浓度下仍有较好的检测结果，并实现了目的基因的1个拷贝的检测，与普通单基因疾病检测相比具有效率高、成本低、周期短、特异性强的特点，且检测材料稳定、操作难度低，结果直观可靠，十分有望投入实际应用。

主权项

1.检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片，其特征在于，构建方法包括如下步骤：(1)化学合成含有Cas12a蛋白序列的大肠杆菌表达载体、特异性底物、含有PAM序列的PCR上游引物、下游引物、荧光探针，以及对应于Cas12a和相应单基因突变疾病的crRNA，确定FnCas12a蛋白在大肠杆菌重组质粒中的表达；(2)Cas12a和crRNA的复合物对特异性底物——双链DNA进行特异性切割的体系的构建,包括对双链DNA切割实验比例的优化、对PCR扩增片段的切割；(3)Cas12a和crRNA的复合物对单链DNA进行非特异性切割的体系的构建,包括对普通单链DNA的切割、对荧光探针单链DNA的切割；(4)将芯片基底进行疏水蛋白修饰；(5)构建高通量芯片基底，包括疏水蛋白对Cas12a‑crRNA复合物的固定、复合物对特异性底物的特异性切割和对荧光探针的非特异性切割。