[发明专利]一种永生化罗非鱼巨噬细胞系的建立及鉴定方法

摘要

本发明公开一种永生化罗非鱼巨噬细胞系的建立及鉴定方法，属于细胞生物学技术领域。本发明在分离纯化罗非鱼腹腔巨噬细胞的基础上，利用EBV病毒感染巨噬细胞，通过筛选单克隆细胞的方法，经传代稳定性、体外增殖、端粒酶活性、核型及特异性基因检测等实验鉴定，获得了能连续传代且功能确切的永生化罗非鱼巨噬细胞系。本发明永生化罗非鱼巨噬细胞系为开展病原特性及其致病机理研究、疫苗研制以及功能基因研究等相关领域的理论与应用研究提供了便利。

主权项

一种永生化罗非鱼巨噬细胞系的建立方法，其特征在于，具体步骤如下：1）挑选体重为100g±5g健康尼罗罗非鱼，于28‑30℃水温条件下在充气水族箱中饲养，正常喂食7天后，对每尾罗非鱼腹腔注射250μL 角鲨烯，每隔2天注射相同剂量角鲨烯，连续注射3次，并于分离细胞前一天停止喂食；2）在注射角鲨烯第7天后，使用100mg/L的MS‑222麻醉试验鱼，75%酒精消毒体表；再用预冷的PBS冲洗腹腔，收集冲洗液于45ml离心管中，300g、4℃离心10min；吸去上清，细胞沉淀用HBSS重悬，300g、4℃离心10min洗涤1次；细胞重悬于2mlHBSS，加入9ml灭菌三蒸水作用20s破裂红细胞，立即加入1ml 10×HBSS；300g、4℃离心10min，HBSS洗涤2次，最后用L‑15培养基重悬细胞，进行稀释后台盼蓝染色，计算活细胞数，瑞氏染色观察细胞状态；然后分别用含100IU/ml氨苄青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、10%FBS的L‑15培养基调整细胞密度约为1×106个/ml，于12孔板中28℃培养24h后吸去悬浮细胞，加入新培养基继续培养；在不同培养时间，吸去培养上清，加入瑞氏染色液染色5‑10min，PBS洗涤2次，于倒置显微镜下观察细胞形态；3）将细胞消化后铺至96孔板中，每孔100 uL已转染的细胞悬液，将培养板在培养箱孵育30min后，向每孔加入10 μL MTT溶液；将培养板在培养箱内孵育1‑4小时，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，得罗非鱼巨噬细胞； 4）将B985细胞置于L15培养基+10％胎牛血清+1％双抗于28℃培养箱培养；B958细胞大规模培养至10‑15ml后，停止加培养液至培养液完全变黄，得EB病毒，备用；5）收集步骤4）培养液，4℃、4 000 r/min离心30 min：转移上清至另一无菌离心管；4℃、12 000r/min离心120min，弃上清，加入5mL新鲜培养液反复吹打重悬，4℃、3 000 r/min离心20 min，将上清用0.22 μm一次性过滤器过滤得到EBV浓缩液，以1 mL/管无菌分装后于‑70℃保存；6）罗非鱼巨噬细胞生长至60％面积后，用步骤5）EBV浓缩液感染，感染3次，每次间隔2d，每次感染前将细胞置于4℃ 1.5‑3h，向每皿加入1×108个EBV，28℃孵育10 h后，换新鲜培养液；7）感染3次后的罗非鱼巨噬细胞亚克隆至96孔板，挑取单克隆细胞至24孔板中于培养箱中继续培养，选取状态好的细胞扩大培养至10cm皿并于液氮容器中冻存，得EBV病毒罗非鱼巨噬细胞；8）将EBV病毒罗非鱼巨噬细胞从液氮容器中取出，立即将细胞冻存管直接浸入37℃水浴中，在1‑2分钟内摇动细胞冻存管至冻存的细胞完全融化，再放入水平低速离心机，600rpm/min离心5分钟后，用75%酒精消毒细胞冻存管后，小心打开盖子，弃掉冻存液后使用1mL完全培养液重悬细胞，将细胞重悬液接种到细胞培养皿中， 28℃培养箱中静置培养24小时后，更换一次10%FBS‑L15完全培养液，继续在培养箱中培养，细胞汇合度达90%时按每孔2ml接种于24孔细胞培养板中传代培养；9）将步骤8）细胞用胰酶或EDTA消化，传代至3‑4代后，继续传代培养，每3天进行一次传代，连续传代培养30代，在显微镜下观察细胞形态变化，得永生化罗非鱼巨噬细胞；10）将永生化罗非鱼巨噬细胞消化后铺至96孔板中，每孔100 uL细胞悬液，将培养板在培养箱孵育30min ，向每孔加入10 μL MTT溶液，将培养板在培养箱内孵育1、3、5、7、9和11天，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，得永生化罗非鱼巨噬细胞系。