[发明专利]一种检测溶液中MMP9蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，该方法包括以下步骤：⑴设计MMP9特异性小分子配体；⑵小分子配体的化学合成：①制备KF-CaF₂熔融物：②制备对甲基苯磺酰氟；③采用催化剂LDA进行反应得化合物Ⅰ；④HCL气体脱去反应物上Boc基团，得化合物Ⅱ；⑤采用催化剂三乙胺进行反应得化合物Ⅲ；⑥化合物Ⅱ与化合物Ⅲ反应得化合物Ⅳ；⑦化合物Ⅳ与NaOH溶液进行反应得化合物Ⅴ；⑧采用催化剂为O-(四氢-2H-吡喃-2-基)羟基胺、NMM、HOBT和EDC进行反应得化合物Ⅵ；⑨化合物Ⅵ脱去保护基团得MMP9小分子配体；⑶SPR法检测溶液中的MMP9：ⅰ裸金膜芯片的修饰；ⅱ小分子配体的固定；ⅲ非特异性小分子吸附的排除；ⅳ检测溶液中的MMP9蛋白；ⅴMMP9非特异性蛋白吸附的排除。本发明方法灵敏度高。

主权项

一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，包括以下步骤：⑴应用分子对接技术设计MMP9的特异性小分子配体，该MMP9的特异性小分子配体的化学结构式如下：；⑵小分子配体的化学合成：①制备氟化钾‑氟化钙熔融物：将二水氟化钾和氟化钙按物质的量之比为1：1.5~2.5混合，搅拌均匀后研磨1~2h，得到粉末状混合物，该粉末状混合物在140~160℃下真空干燥5~8h，即得氟化钾‑氟化钙熔融物；②在干燥乙腈中依次加入对甲基苯磺酰氯、所述氟化钾‑氟化钙熔融物，常温下搅拌8~12h，反应结束后用沙芯漏斗覆盖2~3cm厚的硅藻土进行过滤，得到滤液，该滤液经30~40℃减压蒸馏，得到白色固体对甲基苯磺酰氟；所述对甲基苯磺酰氯与所述干燥乙腈的质量体积比为5g：30~40mL；所述对甲基苯磺酰氯与所述氟化钾‑氟化钙熔融物的质量比为5g：6~8g；③在无水无氧条件下，在10~12mL四氢呋喃中加入1.5~2.5mol/L二异丙基氨基锂10~11mL，并在‑78℃搅拌5~10分钟，然后缓慢滴入溶于20~25mL干燥THF的4.5~5mL N‑Boc‑4‑哌啶甲酸乙酯，搅拌30min后，缓慢滴入溶于20~25mL THF的所述对甲基苯磺酰氟3.4~3.5g，混合液搅拌8~15min后移至常温搅拌16~20h；反应结束后用饱和氯化铵溶液淬灭，得到pH值为8~9的反应溶液，该反应溶液在常温常压条件下用乙酸乙酯萃取，得到有机层；所述有机层依次经饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在30℃~40℃条件下旋干有机溶剂得黄色油状固体的粗产物；该黄色油状固体的粗产物用石油醚‑丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到淡黄色固体产物，即化合物Ⅰ；④将2 mmol的所述化合物Ⅰ溶于25~30mL乙酸乙酯中，得到反应液，该反应液置于冰浴中，开启搅拌，通入HCL气体至反应物上的Boc基团全部脱去，然后在30℃~40℃条件下旋干有机溶剂，得到白色泡沫状固体产物，即化合物Ⅱ；⑤取1g 3‑溴丙胺氢溴酸盐溶于30~40mL二氯甲烷溶液，开启搅拌，再依次加入0.9~1g二碳酸二叔丁酯、滴加1.9~2.5mL三乙胺，搅拌过夜后，加入2~3mol/L的盐酸溶液15~20mL，分层后得到有机层；所述有机层依次用2~3mol/L的盐酸溶液洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在30~40℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物A；该白色固体粗产物A用石油醚‑丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、碘显色，得到白色固体产物A，即化合物Ⅲ；⑥将4mmol的所述化合物Ⅱ溶于2~3mL DMF中，然后在该溶液中加入溶于2~3mL DMF的4.6~4.7mmol的所述化合物Ⅲ溶液，接着加入3~3.5mmol无水碳酸钾，在55~60℃条件下加热12~18h，得到混合液；所述混合液溶于50~60mL乙酸乙酯中，依次用水洗、饱和碳酸氢钠洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在30~40℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物B；该白色固体粗产物B用石油醚‑丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到白色固体产物B，即化合物Ⅳ；⑦将2mmol的所述化合物Ⅳ加入8~10mL 的体积比为1：1的四氢呋喃和无水甲醇混合液中，缓慢滴加10mmol/L的氢氧化钠溶液2.5~3mL，55~60℃条件下加热反应5~8h，停止反应后，加入3~5mL水和20~25mL无水乙醇形成共沸混合物，在45~55℃条件下旋干溶剂得到白色固体产物A，即化合物Ⅴ；以80%的产率估计投入下一步反应；⑧将1.6mmol的所述化合物Ⅴ溶于2~3mL  DMF中，开启搅拌，依次加入2.3~2.5mmol的 O‑(四氢‑2H‑吡喃‑2‑基)羟基胺、4.5~5mmol的NMM、4.5~5mmol的HOBT，搅拌10~20 min后加入2.3~2.5mmol的EDC，得到反应液，该反应液在常温下搅拌48~72h，反应结束后加入50~60mL乙酸乙酯在常温常压的条件下萃取，得到有机层；所述有机层依次用水洗、饱和碳酸氢钠洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在30~40℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物C，该白色固体粗产物C用石油醚‑丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到白色固体化合物Ⅵ，即MMP9小分子探针的阴性对照小分子；⑨将1mmol的所述化合物Ⅵ溶于20~30mL的5~6 mol/L的1，4二氧六环‑无水甲醇溶液中，缓慢通入HCL气体，常温搅拌2~4h；然后滴加15~18mL无水乙醚至白色沉淀不再增多，用三乙胺调节pH值至8~8.5，过滤后在30~40℃下旋干有机溶剂，得到白色固体；向所述白色固体中加入1~3mL饱和氨的甲醇溶液，在30℃~40℃下旋干溶剂，得到白色固体产物B，即MMP9小分子配体；⑶SPR法检测溶液中的MMP9：ⅰ裸金膜芯片的修饰：将玻片用N₂吹干，置于镀膜平台上，在所述玻片上先镀上厚度为2~3 nm的Cr膜，然后在该Cr层上镀厚度为8~10 nm的Au膜，得到金膜芯片；将所述金膜芯片插入到含有4~6mmol/L胱胺的体积浓度为70~85%乙醇溶液中反应6~8h，在所述金膜表面形成尾部带有伯胺基团的单子分子自组装膜，即得修饰有氨基基团的金膜芯片；将所述修饰有氨基基团的金膜芯片插入到浓度为0.2~0.3%w/v的交联剂对苯二异硫氰酸酯的溶液中，反应2~3h；然后依次用DMF和无水乙醇淋洗，再用N₂吹干，得到表面修饰有‑N=C=S基团的金膜芯片；ⅱ小分子配体的固定：将所述表面修饰有‑N=C=S基团的金膜芯片固定到SPR仪器上；将浓度为3.5mmol/L的所述 MMP9小分子配体以10~100μL/min的恒定流速注射到所述表面修饰有‑N=C=S基团的金膜芯片表面，通过SPR仪观察，当动力学曲线基本走平；再次以10~100μL/min的恒定流速注入浓度为10 mmol/L的所述 MMP9小分子配体，当动力学曲线不再随小分子配体浓度的升高而变化，此时所述 MMP9小分子配体在所述表面修饰有‑N=C=S基团的金膜芯片表面覆盖率已基本饱和，即得固定有小分子探针的金膜芯片；ⅲ非特异性小分子吸附的排除：在与所述步骤ⅱ实验条件一致的情况下，依次以10~100μL/min的恒定流速将浓度为3.5mmol/L、浓度为10 mmol/L的所述MMP9小分子探针的阴性对照小分子注射到所述表面修饰有‑N=C=S基团的金膜芯片表面，通过SPR仪观察，当其反应前后的SPR共振角变化明显小于所述步骤ⅱ中MMP9小分子配体固定后的共振角变化，即排除了非特异性吸附的存在；ⅳSPR法检测溶液中的MMP9蛋白：以10~100μL/min的恒定流速，将浓度为100ng/mL的MMP9注射到所述固定有小分子探针的金膜芯片表面，当动力学曲线不再随MMP9蛋白浓度的升高而变化，此时金膜芯片表面的MMP9蛋白覆盖率已基本饱和，即100ng/mL为MMP9蛋白检测的最低浓度；ⅴMMP9非特异性蛋白吸附的排除：在与所述步骤ⅳ实验条件一致的情况下，将浓度为100ng/mL的白蛋白注射到所述固定有小分子探针的金膜芯片表面，通过SPR仪观察，当其反应前后的SPR共振角变化明显小于所述步骤ⅳMMP9固定后的共振角变化，即排除了非特异性吸附的存在。