[发明专利]一种多段DNA并行组装的方法

摘要

本发明涉及的是一种多段DNA并行组装的方法。选择利用环形或线形单元载体置入到环形宿主或线形宿主，形成基因载体，再通过回收环形或线形载体，得到重组后的DNA遗传物质。其特点是，能够实现多段DNA的并行同时操作，从而提高DNA组装形成新的DNA结构的效率，并且防止DNA污染和歧化，保证组装后DNA的质量，使之达到设计目的。组装多段DNA所需时间与log(N)近似成正比。组装操作在细胞外或者细胞内进行，使多段DNA分子能够按照任意顺序拼接形成新的DNA结构体。适宜在遗传工程领域基因重组获得新的生物体中应用。

主权项

一种多段DNA并行组装的方法，其特征是：对待组装片段进行克隆，得到符合“广义单元载体”结构的单元载体；根据单元载体的“组装职能”选出一系列含有不同待组装片段的广义单元载体，形成“可组装队列”；对“可组装队列“进行“队列并行组装”；具体步骤：(1)首先，根据组装实施者的需要，将“待组装片段”克隆到“空单元载体”当中形成“单元载体”；取含有待组装片段的“单元载体”和其他“广义单元载体”构成至少一种“初始可组装队列”；然后，对“初始可组装队列”进行“队列并行组装”，直到形成的“可组装队列”中单元载体数量等于1；最后队列中所得的1个载体，包含按照组装实施者需要设计顺序排列的所有待组装片段的组装产物；并且，(2)组装若在细胞内发生，则所需的重组酶由“辅助质粒”表达；组装若在细胞外发生，则所需的重组酶以蛋白形式直接加入；并且，(3)当“队列并行组装”需要时，组装过程中有“辅助质粒”、“组装宿主”、“回收载体”的辅助；所述“广义单元载体”包括“单元载体”和“组装宿主”；所述“单元载体”的结构特征如下：“单元载体”结构具有以下2种可能性：(1)一种是含有单重构位点“单元载体”，按序列顺序依次包括：左臂、左反应端、待组装片段、右反应端、右臂、拓扑重构位点、接左臂；或者，(2)另一种是含有双重构位点单元载体，按序列顺序依次包括：固定臂、回收重构位点、左臂、左反应端、待组装片段、右反应端、右臂、拓扑重构位点、接前述固定臂；所述“待组装片段”连接到“空单元载体”当中形成含有“待组装片段”的“单元载体”；所述“组装宿主”是“待组装片段”长度为0的“单元载体”，具有如下结构特征：固定臂、回收重构位点、左臂、左反应端和右反应端有至少其一、右臂、拓扑重构位点、接前述固定臂；所述“广义单元载体”具有如下特征：(1) “广义单元载体”的“组装职能”类型的差别在于左反应端、右反应端、拓扑重构位点、回收重构位点的差别；并且，(2) “广义单元载体”有至少1种类型的“组装职能”；并且，(3)不同种类型“组装职能”的“广义单元载体”的反应端和重构位点的选择要满足：任何一种“组装职能”的“广义单元载体”，并且至少存在一种“组装职能”的“广义单元载体”与其“互相匹配”;并且，(4) “广义单元载体”的“组装职能”的所有种类要满足：对于任意数量待组装片段，至少存在一种“可组装队列”；所述“回收载体”的结构特征如下：(1) “回收载体”具有回收重构位点、左反应端、右反应端、拓扑重构位点、接前述固定臂4个重组位点当中至少其中2个；并且，(2)“回收载体”与“匹配”的“广义单元载体”进行“载体置换”的目的产物仍然为“广义单元载体”；所述“待组装片段”，是组装实施者需要组装的片段；“待组装片段”的DNA序列，允许是任意不参与反应端、拓扑重构位点、回收重构位点的重组的，并且不参与复制子和筛选标记的筛选的DNA序列； 所述待组装片段的“左反应端”和“右反应端”是具有发生重组能力的DNA序列；并且，在“组装反应”中，同一个单元载体内的左反应端和右反应端不具有互相重组能力；并且，在“组装反应”中，来自不同“组装职能”的“广义单元载体”的左反应端和右反应端重组后消失或者变为在该重组酶下没有重组活性的DNA序列；并且，“左反应端”和“右反应端”来自于空单元载体、或者来自于待组装片段；所述“拓扑重构位点”是序列特异性重组位点，或者是端粒酶位点，或者是相互断开的2个端粒，并且在同一“组装反应”中具有发生重组能力，并且在同一“组装反应”中不具有与同一载体内的反应端或回收重构位点重组的能力；并且，当拓扑重构位点是相互断开的2个端粒时，含有拓扑重构位点的载体DNA分子在拓扑结构上为线形； 所述“回收重构位点”是在“组装反应”中具有发生重组能力的DNA序列，并且在同一“组装反应”中不具有与同一载体内的任何反应端重组的能力，并且同一“组装反应”中不具有与同一载体内的拓扑重构位点重组的能力；所述“固定臂”、“左臂”、“右臂”，是任意在“组装反应”中不具有与反应端、拓扑重构位点、回收重构位点重组能力的DNA序列，其中包括至少一个复制子和至少一个筛选标记；所述“置换臂”，是任意不参与反应端、拓扑重构位点、回收重构位点的重组的DNA序列；所述“回收载体”与“广义单元载体”的“位点匹配”具有如下3点特征：(1) “回收载体”包含的重组位点中与“广义单元载体”的回收重构位点、左反应端、右反应端、拓扑重构位点重组位点当中至少2个具有发生重组的能力；并且，(2)“回收载体”与“广义单元载体”发生“载体置换”之后的目的产物符合“广义单元载体”的结构特征，并且具有区别于反应前的筛选特征；所述“回收载体”与“广义单元载体”的“载体置换”定义包括如下2个反应的：(1) “回收载体”与“广义单元载体”回收重构位点、左反应端、右反应端、拓扑重构位点4个重组位点当中至少具有其中2个发生重组；所述“载体置换”的目的产物是“载体置换”反应后，得到反应物当中“广义单元载体”的“待组装片段”的、并且符合“广义单元载体”特征的载体；所述“广义单元载体”的“互相匹配”定义为同时满足以下三个条件：(1)满足反应端匹配：2个单元载体，或者至多其中2个单元载体经过“载体置换”之后，其中一个单元载体的右反应端具有与另一个单元载体的左反应端重组的能力，或者其中一个单元载体的左反应端具有与另一个单元载体的右反应端重组的能力；上述两种情况在同一种酶催化下不同时发生；该重组定义为“反应端匹配重组”；并且，(2)满足重构位点匹配：2个单元载体本身，或者至多其中两者单元载体经过“载体置换”之后，在同一种酶催化下，其中一个单元载体与另一个单元载体的拓扑重构位点具有重组能力，或者其中一个单元载体与另一个单元载体的拓扑重构位点同时为断开的端粒形式，或者其中一个单元载体与另一个单元载体的回收重构位点具有重组能力；上述三种情况在同一种酶催化下不同时发生；该重组定义为“重构位点匹配重组”；并且，(3)满足筛选特征匹配：互相匹配的2个单元载体本身，或者至多其中两者单元载体经过“载体置换”之后，单元载体之间进行组装的每一步重组产物，都有区别于过反应前体的筛选特征变化；所述“匹配单元载体对”定义为满足“互相匹配”关系的2个“广义单元载体”； 所述“组装反应”是“互相匹配”的2个“广义单元载体”之间发生的重组反应，其特征如下：(1)在“互相匹配”需要的情况下先与“回收载体”进行所需的“载体置换”，然后发生“反应端匹配重组”和“重构位点匹配重组”2个重组；并且，(2)“组装反应”产物是重组反应产物当中含有其2个“广义单元载体”前体中所包含的所有待组装片段的载体；根据所述单元载体的结构，“组装反应”的产物，满足单元载体的定义，仍称为“单元载体”，具有继续与匹配的“广义单元载体”发生组装反应的能力；所述“可组装队列”是由“广义单元载体”构成的队列；并且满足：当队列中“广义单元载体”数量为2N或者2N+1，且N为非负整数，队列中可挑选出不超过N个互不共用“广义单元载体”的“匹配单元载体对”，这不超过N个的“匹配单元载体对”发生“组装反应”后得到的“广义单元载体”替代原队列中的这些“匹配单元载体对”，得到的队列，仍然符合“可组装队列”的条件；所述“初始可组装队列”是一个“可组装队列”，由含有“待组装片段”的单元载体和“组装宿主”构成；并且，队列中含有“待组装片段”的“单元载体”的数量与所需组装的片段的数量一致，并且，每个“单元载体”含有一个待组装片段；并且，队列中的单元载体所含的待组装片段的顺序与组装实施者的目的组装顺序一致； 所述“队列并行组装”定义为如下过程：根据前述定义，在“广义单元载体”数量为2N或者2N+1(N为非负整数)的“可组装队列”中存在的不超过N个互不共用单元载体的“匹配单元载体对”，使这不超过N个“匹配单元载体对”同时并行进行“组装反应”，并用每个“匹配单元载体对”的“组装反应”产物或“宿主中间体”替代原“匹配单元载体对”；广义单元载体：(1)所述“广义单元载体”的“组装职能”的所有种类进一步满足：对于任意数量的“待组装片段”，至少存在一种“匹配组装队列”;并且，(2)通过挑选“匹配”的“广义单元载体”，使所述“初始可组装队列”满足“匹配组装队列”的要求；并且，(3) 对满足“匹配组装队列”要求的“初始可组装队列”进行“队列并行匹配组装”；所述“匹配组装队列”是满足以下2个条件的“可组装队列”：(1)当队列中“广义单元载体”数量为2N或者2N+1，且N为非负整数，则队列中存在N个互不共用“广义单元载体”的“匹配单元载体对”；并且，(2)用前述N个“匹配单元载体对”发生“组装反应”后得到的“广义单元载体”替代原队列中的这些“匹配单元载体对”，得到的队列，仍然符合“匹配组装队列”的条件；所述“队列并行匹配组装”定义为如下过程：根据前述定义，在“广义单元载体”数量为2N或者2N+1，且N为非负整数的“匹配组装队列”中存在的N个互不共用“广义单元载体”的“匹配单元载体对”，使这N个“匹配单元载体对”同时并行进行“组装反应”，并用每个“匹配单元载体对”的“组装反应”产物替代原“匹配单元载体对”；第一种筛选标记：(1)筛选标记有至少1种，每种“单元载体”的左臂或右臂之一带有筛选标记；并且，(2)“组装反应”发生时，在“组装宿主”所在的细胞中，“单元载体”不具有复制能力；并且，“组装宿主”为染色体；并且，回收载体在特定辅助质粒存在时具有在组装宿主中复制的能力；并且，(3)“单元载体”和“组装宿主”发生“反应端匹配重组”、“重构位点匹配重组”的其中一组后，利用“单元载体”的筛选标记筛选到中间体进行筛选含有单元载体的筛选标记的中间产物；中间产物再发生“反应端匹配重组”、“重构位点匹配重组”的其中的另一组后，利用“单元载体”所带的筛选标记的丢失筛选“组装反应”产物；并且，(4)“载体置换”目的产物的筛选：“广义单元载体”和“回收载体”发生“载体置换”反应的2个重组的其中一个后，利用“回收载体”的筛选标记筛选到中间体；中间体再发生“载体置换”反应的2个重组的其中的另一个，利用“回收载体”在特定复制蛋白下可复制筛选到“载体置换”产物；并且，(5) “辅助质粒”为温度敏感性载体；并且，在每一步重组前将辅助质粒转化到宿主细胞；并且，在每一步重组后在“辅助质粒”不具有复制能力的温度下培养，将辅助质粒从宿主细胞中去除；第二种筛选标记：(1)筛选标记有至少2种，每种“组装职能”的“单元载体”的左臂或右臂各带有一种筛选标记，且两臂所带有的筛选标记互不相同；并且，“组装反应”发生时，在“组装宿主”所在的宿主细胞中，“单元载体”不具有复制能力；并且，“组装宿主”为染色体，有至少2种不同“组装职能”的组装宿主，每种含有一种不同的筛选标记；并且，“回收载体”在含有其复制所需的复制蛋白的“辅助质粒”存在时具有在宿主细胞中复制的能力；(2)“单元载体”和“广义单元载体”发生“组装反应”后，利用“广义单元载体”所带的筛选标记的被“单元载体”的筛选标记替换来筛选“组装反应”产物；(3) “广义单元载体”和“回收载体”发生“载体置换”反应的2个重组的其中一个后，利用“回收载体”和“广义单元载体”2个筛选标记筛选到“载体置换”产物；第三种筛选标记：(1)筛选标记有至少3种，每种“单元载体”的左臂和右臂各带有一种筛选标记，且两臂所带有的筛选标记互不相同；并且，(2)“组装反应”所包含的2个重组同时进行；并且，“组装反应”的目的产物含有不同于其2个“单元载体”前前体的筛选标记组合，使该产物具有通过这种筛选标记组合从重组产物、副产物和未发生反应的单元载体的混合物种筛选出来的操作性;并且，(3)组装过程不需要“回收载体”和“组装宿主”；并且，(4)“辅助质粒”同时表达“组装反应”包含的2个反应所需的2个重组酶； 反应端、回收重构位点、拓扑重构位点：所述反应端、回收重构位点、拓扑重构位点为frt，loxP，Lambda噬菌体的重组位点attB, attB1, attB2, attB3, attB4, attB5, attP, attP1, attP2 attP3, attP4, attP5, attL, attL1, attL2, attL3, attL4, attL5, attR, attR1, attR2, attR3, attR4, attR5,HK022噬菌体的重组位点attB, attP, attL, attR, phi80噬菌体的重组位点attB, attP, attL, attR, P21噬菌体的重组位点attB, attP, attL, attR, P22噬菌体的重组位点attB, attP, attL, attR；所述反应端为lambda red重组所需的同源序列；端粒酶识别位点：端粒酶识别位点或端粒为原核生物的端粒酶的识别位点或端粒，包括Enterobacteria phage N15、Vibrio phage VP882、Klebsiella phage phiKO2、Yersinia phage PY54等的端粒酶识别位点；端粒也为真核生物染色体的端粒；单元载体、组装宿主、回收载体：所述单元载体、组装宿主、回收载体为原核生物或者真核生物的质粒、也为原核生物或者真核生物的基因组；单元载体、回收载体的转化位点：所述单元载体、回收载体当中含有接合转化位点，且组装宿主微生物具备接合转化能力时，不需要宿主细胞外的分子操作；所述单元载体、回收载体当中不含有接合转化位点，或且宿主微生物不具备接合转化能力时，需要有宿主细胞外的分子操作；重组位点重组酶：当在细胞外使用重组位点的重组酶时，loxP对应Cre重组酶，frt对应FLP重组酶，Lambda噬菌体的BP重组对应Lambda Int和IHF，Lambda噬菌体的BP重组对应Lambda Int、Xis和IHF，，=HK022噬菌体的BP重组对应HK022 Int和IHF，HK022噬菌体的BP重组对应HK022 Int、Xis和IHF，phi80噬菌体的BP重组对应phi80 Int和IHF，phi80噬菌体的BP重组对应phi80 Int、Xis和IHF，P21噬菌体的BP重组对应P21 Int和IHF，P21噬菌体的BP重组对应P21 Int、Xis和IHF，P22噬菌体的BP重组对应P22 Int和IHF，P22噬菌体的BP重组对应P22 Int、Xis和IHF，组装过程中的重组反应具有在细胞外进行的能力；其中：两个线形载体重组后的单侧端粒发生交换，视为在端粒位点发生了一次重组，因为此过程等效于环形载体的两次重组；例如线形载体A和B端粒标记为T，左右两个端粒分别用L和R区分，在载体中X和Y之间发生重组，如下：TLA‑XA‑YA‑ TRA + TLB‑XB‑YB‑ TRB è TLA‑XA‑YB‑ TRB + TLB‑XB‑YA‑ TRA重组之后，每个载体的X‑Y组合发生交换，同时末端端粒组合也发生交换。