[发明专利]从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法

摘要

一种从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法，经过①制备禽多杀性巴氏杆菌培养液、②从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收集禽多杀性巴氏杆菌菌体、③超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎、④从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖溶液、⑤从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液、⑥用DNA酶和RNA酶来酶解脂多糖浓缩液中的DNA和RNA、⑦制备纯化的脂多糖和⑧将纯化的脂多糖制作成禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗共八个步骤。经动物免疫实验和动物攻毒实验，本发明制备出的禽多杀性巴氏杆菌病脂多糖疫苗给鸡进行三次免疫之后能使被免疫鸡有效地预防禽多杀性巴氏杆菌病。

主权项

一种从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法，该方法经过①制备禽多杀性巴氏杆菌培养液、②从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收集禽多杀性巴氏杆菌菌体、③超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎、④从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖溶液、⑤从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液、⑥用DNA酶和RNA酶来酶解脂多糖浓缩液中的DNA和RNA、⑦制备纯化的脂多糖和⑧将纯化的脂多糖制作成禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗共八个步骤，上述八个步骤中所述的②中涉及到离心机的离心转速，所述的③中涉及到超声波的功率、辐射时间、间歇秒数和辐射次数，所述的⑤中涉及到换水次数，所述的⑥中涉及到酶解时间，所述的⑦中涉及到用浓度为6摩尔/升NaOH来调节溶液的pH值，所述的⑧中涉及到脂多糖溶液与弗氏完全佐剂的体积比均为常规实验技术手段，这些常规实验技术手段中的任一项作为单独实验条件或许是存在的，但这些常规实验技术手段综合应用在“从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法”则是必需的；其特征是：所述的八个步骤分述如下：①制备禽多杀性巴氏杆菌培养液用接种环刮取一环斜面保藏的禽多杀性巴氏杆菌，将刮有一环禽多杀性巴氏杆菌的接种环以“Z”字型划线接种于培养平板上，将培养平板放置于37℃培养箱内培养24小时，挑取培养24小时后的培养平板上生长的一个单菌落接种于5毫升的液体培养基中，将该5毫升的液体培养基放在37℃的摇床中以160转/分钟的速度振荡培养24小时，再将振荡培养的5毫升液体培养基全部倒入200毫升的液体培养基中并在37℃的摇床中以160转/分钟的速度振荡培养24小时制备出禽多杀性巴氏杆菌培养液；②从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收集禽多杀性巴氏杆菌菌体将上述①制备出的禽多杀性巴氏杆菌培养液加入到250毫升的离心管中，将加入禽多杀性巴氏杆菌培养液的该250毫升离心管放在离心机上并在5000转/分钟的转速下离心15分钟，然后将离心15分钟后的250毫升离心管中的上清液弃掉，留在该250毫升离心管中的沉淀物就是所收集的禽多杀性巴氏杆菌菌体；③超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎在上述②中250毫升离心管所收集的禽多杀性巴氏杆菌菌体中加入10毫升的蒸馏水，然后将该250毫升离心管置于超声波破碎仪中，设置超声波破碎仪的功率为500瓦，每超声波辐射20秒后停止辐射20秒为一个破碎循环过程，所有破碎循环过程共持续30分钟，30分钟后该250毫升离心管中得到的就是经超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体；④从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖溶液从禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖分为三步，三步分述如下：第一步，提取上述③中经超声波破碎得到的禽多杀性巴氏杆菌菌体10毫升并加入到50毫升离心管中，然后再向该50毫升离心管中加入10毫升其浓度为90%的苯酚，颠倒该50毫升离心管数次使10毫升禽多杀性巴氏杆菌菌体和10毫升苯酚充分混匀，然后将充分混匀的该50毫升离心管放置在70℃的水浴锅中加热并用玻璃棒快速搅拌30分钟，30分钟后从水浴锅中取出该50毫升离心管并在室温下放置20分钟，再将该50毫升离心管放在离心机上并在4000转/分钟的转速下离心30分钟，离心结束后将该50毫升离心管的上层溶液吸取并加入到另一50毫升的三角瓶中、该50毫升离心管中的中层溶液弃掉不要、最后再向该50毫升离心管中的下层溶液中加入蒸馏水补足体积至10毫升待用；第二步，向第一步中待用的该50毫升离心管中的下层溶液+蒸馏水中加入10毫升其浓度为90%的苯酚，颠倒该50毫升离心管数次使其充分混匀，充分混匀后将该50毫升离心管放置在70℃的水浴锅中加热并用玻璃棒快速搅拌30分钟，30分钟后从水浴锅中取出该50毫升离心管并在室温下放置20分钟，再将该50毫升离心管放在离心机上并在4000转/分钟的转速下离心30分钟，离心结束后将该50毫升离心管的上层溶液吸取并加入到第一步中的另一50毫升的三角瓶中存储、该50毫升离心管中的中层溶液弃掉不要、最后再向该50毫升离心管中的下层溶液中加入蒸馏水补足体积至10毫升准备再次使用；第三步，重复第二步数次直至将另一50毫升的三角瓶储满刻度为止，存储满50毫升的另一50毫升三角瓶中的所述上层溶液就是从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提的脂多糖溶液；⑤从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液将粗提的50毫升脂多糖溶液全部加入到透析袋中，将透析袋放在自来水流水中持续冲洗48小时，再将透析袋放入到蒸馏水中浸泡，每6小时浸泡换一次蒸馏水共换蒸馏水8次，然后将透析袋放入装有聚乙二醇6000的烧杯中进行浓缩，直到透析袋中的50毫升脂多糖溶液被浓缩到7.5毫升浓缩液为止，透析袋中所述7.5毫升浓缩液即为脂多糖浓缩液；⑥用DNA酶和RNA酶来酶解脂多糖浓缩液中的DNA和RNA将上述⑤中的所述7.5毫升脂多糖浓缩液倒入10毫升的离心管中，再向该10毫升离心管中分别加入375微克的DNA酶和RNA酶；将该10毫升离心管放在37℃水浴中放置5小时，再将该10毫升离心管放在100℃水浴中放置10分钟，放置10分钟后从100℃水浴中取出该10毫升离心管并冷却至室温，在室温条件下将该10毫升离心管放在离心机上并在3000转/分钟的转速下离心30分钟，离心30分钟后将该10毫升离心管中的上清液吸取并倒入另一100毫升的离心管中备用；⑦制备纯化的脂多糖向上述⑥备用的另一100毫升离心管中加入体积是其上述⑥所述上清液液体6倍的无水乙醇并用6摩尔/升的NaOH调节pH值至9.0，再将该另一100毫升离心管在4℃时放置12小时，然后在离心机上并在6000转/分钟的转速下离心15分钟，离心15分钟后将该另一100毫升离心管中的液体倒掉、留在该另一100毫升离心管中的沉淀物即为所制备纯化的脂多糖；⑧将纯化的脂多糖制作成禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗在上述⑦另一100毫升离心管中所制备纯化的脂多糖中加入1毫升的超纯水进行溶解并得到高浓度的脂多糖溶液，用蒽酮法测定所述脂多糖溶液的浓度，缓慢加入超纯水至所述脂多糖溶液的浓度达到0.5毫克/毫升为止；向上述浓度为0.5毫克/毫升的所述脂多糖溶液中倒入50毫升烧杯中，再向该50毫升烧杯中加入体积是所述脂多糖溶液体积1.5倍的弗氏完全佐剂，同时在该50毫升烧杯中放入一磁力棒并在磁力搅拌器作用下搅拌1小时，搅拌1小时后在该50毫升烧杯中的溶液就是制作的禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗。