本发明提供了一种表达犬IL‑12的重组质粒及表达犬IL‑12蛋白的细胞株的制备方法和应用，本发明的重组质粒为连接有核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示基因片段的表达载体。本发明以含有IGK信号肽和His标签的核酸序列的基因片段与表达载体连接制备重组质粒，所述重组质粒导入哺乳动物细胞系并筛选得到高表达犬IL‑12蛋白的细胞株，本发明的高表达犬IL‑12蛋白的细胞株的蛋白表达量远高于未添加IGK信号肽的IL‑12基因片段制备的重组质粒导入哺乳动物细胞系并筛选得到高表达犬IL‑12蛋白的细胞株；本发明为获得高表达犬IL‑12蛋白提供了新的方法，也为犬IL‑12蛋白的进一步研究和利用提供了基础。
本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒ORF1基因全序列的扩增方法，扩增方法中涉及8对引物，各引物对上下游引物依次如SEQ ID NO.1～16。具体扩增步骤为提取PEDV总RNA，反转成cDNA，用所述8对引物进行扩增反应，将PCR产物连接到克隆载体pTA2 Vector中，转化TOP10感受态细胞，选取阳性克隆，测序鉴定，最后拼接序列，得到ORF1基因组全序列。可以通过该方法扩增获取病料中猪流行性腹泻病毒变异株的ORF1基因，并可以捕获猪流行性腹泻病毒变异株在细胞培养传代过程中基因序列的变化。也可以作为一种检测病料中PEDV的方法，并为PEDV的ORF1基因相关研究奠定基础。
本发明公开了一种表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法。其中编码融合表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；融合表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明首次融合表达了狂犬病病毒G蛋白与Fc片段。本发明利用杆状病毒表达系统构建的重组杆状病毒对外源蛋白表达稳定，而且其效价稳定。该融蛋白因融合了Fc片段，能利跨越粘膜屏障，转运到粘膜固有层，被抗原递呈细胞摄取后，再递呈给T细胞，引起机体的适应性免疫，这将为狂犬病口服疫苗的研究和制备提供一个新的策略，在狂犬病的防治方面具有广阔的研究前景。
本发明公开了一种携带去优化M基因和两个G基因的重组狂犬病病毒。本发明首先将M基因阅读框部分进行去优化，优化后序列如SEQ ID NO.2所示。然后以狂犬病病毒HEP‑Flury株为骨架，将去优化后M基因替换HEP‑Flury中的M基因，再插入额外一个狂犬病毒的G基因，得到携带去优化M基因和两个G基因的重组狂犬病病毒pHEP‑dG‑Mmin质粒，最后拯救筛选获得重组狂犬病病毒株rHEP‑dG‑Mmin。该重组病毒具有更高的病毒滴度，可以降低犬用疫苗的成本。高感染复数时能够表达更高水平的G蛋白且病毒的复制和各结构基因的转录都增高，有作为狂犬病疫苗候选株的潜力。
本发明提供一种VP2融合基因、重组狂犬病病毒rHEP‑rVP2株、构建方法及其应用，属于微生物免疫学领域。VP2融合基因序列如SEQ ID NO:1所示。重组狂犬病病毒rHEP‑rVP2株，是在HEP‑Flury株基因组的G基因和L基因之间插入VP2融合基因后得到的。重组狂犬病病毒rHEP‑rVP2株构建方法，包括在HEP‑Flury株全长cDNA中插入VP2融合基因构建重组质粒，转染宿主细胞，拯救病毒，得到rHEP‑rVP2株。重组狂犬病病毒rHEP‑rVP2株，与亲本株具有相似的病毒滴度，具有较好的免疫原性，免疫后能够产生较高水平针对狂犬病病毒和犬细小病毒抗体，可作为二价疫苗候选毒株。
