本发明公开了靶向UTY基因的sgRNA和利用其整合外源基因的绵羊成纤维细胞系及其应用。具体地公开了靶向UTY基因的sgRNA，其靶序列为SEQ ID No.1。本发明还公开了一种构建定点整合外源基因的细胞系的方法，包括利用CRISPR/Cas9系统通过HMEJ方法介导的重组将外源基因定点整合到受体细胞的UTY基因的靶点中的步骤。本发明在山羊成纤维细胞中筛选了UTY基因内含子上的高效sgRNA，并在该位点采用HMEJ方法介导的重组定点整合了tdTomato基因，获得了标记Y染色体的绵羊成纤维细胞，该细胞能够结合体细胞核移植技术获得转基因绵羊，从而用于分离XY精子，最终用于性别控制。
本发明公开了密码子优化的Cas12i3蛋白编码基因及其应用。具体地公开了DNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID No.3。本发明还公开了含有所述DNA分子的基因编辑系统，以及提高Cas12i3蛋白介导的基因编辑的效率的方法。本发明为了更好的将Cas12i3蛋白应用于哺乳动物基因编辑，设计了不同密码子优化方案，通过软件评估和实验验证，比较筛选出Cas12i3表达量和编辑效果好的密码子优化方案。本发明筛选到在哺乳动物中高效表达Cas12i3蛋白的密码子优化方案，可以极大地提高Cas12i3蛋白的编辑效率，为Cas12i3蛋白在哺乳动物中的广泛应用奠定了基础，有较大的实际应用价值。
本发明公开了融合蛋白及其在基因编辑中的应用。具体地公开了提高基因编辑效率的融合蛋白，所述融合蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.9、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.13的蛋白质。本发明还提供了基因编辑系统和提高Cas12i3蛋白介导的基因编辑效率的方法。本发明通过筛选获得了可显著提高Cas酶编辑效率的T5核酸外切酶和linker编码序列核酸分子组合。按照该组合方式得到的融合蛋白比未改造的Cas12i3蛋白编辑效率显著提高。进一步流式分析结果显示，经过C‑linker 3组合方式改造，更显著提高了Cas酶的编辑效率。本发明的基因编辑系统编辑效率高，有更广泛的应用价值和前景。
发明公开了一种检测绵羊肺炎支原体的巢式qPCR试剂盒。具体地公开了用于检测绵羊肺炎支原体的组合物，包括外引物对、内引物对和探针(SEQ ID No.7)，外引物对由锁核酸修饰的外引物F(SEQ ID No.3)和外引物R(SEQ ID No.4)组成；内引物对由内引物F(SEQ ID No.5)和内引物R(SEQ ID No.6)组成。本发明根据绵羊肺炎支原体16S rRNA基因的保守序列设计了特异性引物和探针，并建立了基于巢式qPCR的绵羊肺炎支原体检测方法。该方法灵敏、特异、稳定、快速，能检测到101copies/μL的重组质粒标准品溶液，是常规qPCR的10倍。
本发明公开了一种工程改造的同向重复序列及其gRNA与应用。具体地公开了核苷酸序列为SEQ ID No.5的第14‑36位或SEQ ID No.5的RNA。本发明还公开了包括所述RNA和靶向目的基因的靶向序列的gRNA、基因编辑系统及其应用，以及提高基因编辑效率的方法。本发明对野生型同向重复序列进行工程改造，得到同向重复序列DRf‑4。结果表明，本发明同向重复序列DRf‑4提高了gRNA茎环结构的稳定性，显著地提高了Cas蛋白的编辑活性，其与靶向序列所构成的gRNA在Cas蛋白的作用下，显著提高了Cas蛋白的基因编辑效率。该同向重复序列及其gRNA在基因编辑领域有着广泛的应用前景。
本发明公开了靶向ZFY基因的sgRNA和利用其整合外源基因的绵羊成纤维细胞系的建立。具体地公开了靶向ZFY基因的sgRNA，其靶序列为SEQ ID No.1。本发明还公开了一种构建定点整合外源基因的细胞系的方法，包括利用CRISPR/Cas9系统通过HMEJ方法介导的重组将外源基因定点整合到受体细胞的ZFY基因的靶点中的步骤。本发明在山羊成纤维细胞中筛选了ZFY基因第一内含子上的有效sgRNA，并在该位点采用HMEJ方法介导的重组定点整合了tdTomato基因，获得了标记Y染色体的绵羊成纤维细胞，该细胞能够结合体细胞核移植技术获得转基因绵羊，从而用于分离XY精子，最终用于性别控制。
本发明公开了靶向ZFX基因的sgRNA和利用其整合外源基因的绵羊成纤维细胞系的建立与应用。具体地公开了靶向ZFX基因的sgRNA，其靶序列为SEQ ID No.1。本发明还公开了一种构建定点整合外源基因的细胞系的方法，包括利用CRISPR/Cas9系统通过HMEJ方法介导的重组将外源基因定点整合到受体细胞的ZFX基因的靶点中的步骤。本发明在山羊成纤维细胞中筛选了ZFX基因第一内含子上的有效sgRNA，并在该位点采用HMEJ方法介导的重组定点整合了tdTomato基因，获得了标记X染色体的绵羊成纤维细胞，该细胞能够结合体细胞核移植技术获得转基因绵羊，从而用于分离XY精子，最终用于性别控制。
本发明公开了一种抗金黄色葡萄球菌遗传修饰山羊生产方法。具体地公开了一种将TLR2‑4嵌合基因(SEQ ID No.1)导入山羊的体细胞中，由转化的体细胞再生出遗传修饰山羊的方法，所述TLR2‑4嵌合基因包括TLR2基因的胞外区、TLR4基因的跨膜区与胞内区。本发明使用CRISPA/Cas9系统将TLR2‑4嵌合基因定点整合到山羊SETD5基因第一内含子上，利用体细胞核移植技术制备表达TLR2‑4嵌合蛋白的转基因山羊，构建的转基因山羊提高了抗金黄色葡萄球菌能力并且增强了免疫力，达到通过山羊自身的先天免疫有效防控金黄色葡萄球菌引起的山羊乳腺炎的目的。为抗金黄色葡萄球菌山羊新种质的制备奠定基础。
