本发明公开了靶向UTY基因的sgRNA和利用其整合外源基因的绵羊成纤维细胞系及其应用。具体地公开了靶向UTY基因的sgRNA，其靶序列为SEQ ID No.1。本发明还公开了一种构建定点整合外源基因的细胞系的方法，包括利用CRISPR/Cas9系统通过HMEJ方法介导的重组将外源基因定点整合到受体细胞的UTY基因的靶点中的步骤。本发明在山羊成纤维细胞中筛选了UTY基因内含子上的高效sgRNA，并在该位点采用HMEJ方法介导的重组定点整合了tdTomato基因，获得了标记Y染色体的绵羊成纤维细胞，该细胞能够结合体细胞核移植技术获得转基因绵羊，从而用于分离XY精子，最终用于性别控制。
本发明公开了密码子优化的Cas12i3蛋白编码基因及其应用。具体地公开了DNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID No.3。本发明还公开了含有所述DNA分子的基因编辑系统，以及提高Cas12i3蛋白介导的基因编辑的效率的方法。本发明为了更好的将Cas12i3蛋白应用于哺乳动物基因编辑，设计了不同密码子优化方案，通过软件评估和实验验证，比较筛选出Cas12i3表达量和编辑效果好的密码子优化方案。本发明筛选到在哺乳动物中高效表达Cas12i3蛋白的密码子优化方案，可以极大地提高Cas12i3蛋白的编辑效率，为Cas12i3蛋白在哺乳动物中的广泛应用奠定了基础，有较大的实际应用价值。
本发明公开了融合蛋白及其在基因编辑中的应用。具体地公开了提高基因编辑效率的融合蛋白，所述融合蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.9、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.13的蛋白质。本发明还提供了基因编辑系统和提高Cas12i3蛋白介导的基因编辑效率的方法。本发明通过筛选获得了可显著提高Cas酶编辑效率的T5核酸外切酶和linker编码序列核酸分子组合。按照该组合方式得到的融合蛋白比未改造的Cas12i3蛋白编辑效率显著提高。进一步流式分析结果显示，经过C‑linker 3组合方式改造，更显著提高了Cas酶的编辑效率。本发明的基因编辑系统编辑效率高，有更广泛的应用价值和前景。
本发明公开了一种工程改造的同向重复序列及其gRNA与应用。具体地公开了核苷酸序列为SEQ ID No.5的第14‑36位或SEQ ID No.5的RNA。本发明还公开了包括所述RNA和靶向目的基因的靶向序列的gRNA、基因编辑系统及其应用，以及提高基因编辑效率的方法。本发明对野生型同向重复序列进行工程改造，得到同向重复序列DRf‑4。结果表明，本发明同向重复序列DRf‑4提高了gRNA茎环结构的稳定性，显著地提高了Cas蛋白的编辑活性，其与靶向序列所构成的gRNA在Cas蛋白的作用下，显著提高了Cas蛋白的基因编辑效率。该同向重复序列及其gRNA在基因编辑领域有着广泛的应用前景。
本发明公开了靶向ZFY基因的sgRNA和利用其整合外源基因的绵羊成纤维细胞系的建立。具体地公开了靶向ZFY基因的sgRNA，其靶序列为SEQ ID No.1。本发明还公开了一种构建定点整合外源基因的细胞系的方法，包括利用CRISPR/Cas9系统通过HMEJ方法介导的重组将外源基因定点整合到受体细胞的ZFY基因的靶点中的步骤。本发明在山羊成纤维细胞中筛选了ZFY基因第一内含子上的有效sgRNA，并在该位点采用HMEJ方法介导的重组定点整合了tdTomato基因，获得了标记Y染色体的绵羊成纤维细胞，该细胞能够结合体细胞核移植技术获得转基因绵羊，从而用于分离XY精子，最终用于性别控制。
本发明公开了靶向ZFX基因的sgRNA和利用其整合外源基因的绵羊成纤维细胞系的建立与应用。具体地公开了靶向ZFX基因的sgRNA，其靶序列为SEQ ID No.1。本发明还公开了一种构建定点整合外源基因的细胞系的方法，包括利用CRISPR/Cas9系统通过HMEJ方法介导的重组将外源基因定点整合到受体细胞的ZFX基因的靶点中的步骤。本发明在山羊成纤维细胞中筛选了ZFX基因第一内含子上的有效sgRNA，并在该位点采用HMEJ方法介导的重组定点整合了tdTomato基因，获得了标记X染色体的绵羊成纤维细胞，该细胞能够结合体细胞核移植技术获得转基因绵羊，从而用于分离XY精子，最终用于性别控制。
