本发明属于生物医药技术领域,具体公开了一种非洲猪瘟病毒抗原表位肽或其编码核酸、与非洲猪瘟病毒S273R蛋白抗原表位特异性结合的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物、检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。本发明提供的非洲猪瘟病毒S273R蛋白抗原表位为B细胞线性表位,最小抗原表位位于S273R蛋白第136‑140位氨基酸,为包含EELQY核心序列(如SEQ ID NO:3所示)的截短肽。本发明提供的单克隆抗体能够特异性识别并结合该抗原表位,特异性强、稳定性好,为研究S273R蛋白功能以及研发S273R新型疫苗和药物靶标奠定了基础。