本发明公开了一种用于DNA建库的试剂盒及其应用,特别涉及用于外周血cfDNA建库的试剂盒及其应用。本发明首先提供了一种用于DNA建库的试剂盒,包括组件甲和组件乙;组件甲包括配比如下的各个组分:1‑3U T4 PNK:1‑4.5U Klenow Fragment:0.25‑0.5U LA Taq DNA Polymerase:0.3‑0.9U T4 DNA Polymerase:0.5‑2.5nmol dNTP:0.5‑2.5nmol dATP;组件乙包括配比如下的各个组分:2.5‑8nmol ATP:26.5‑132U T4 DNA Ligase:0.213μL‑0.534μLPEG 8000。本发明提供的试剂盒及其应用方法,尽可能减少了建库过程中DNA损失,减少了血浆使用量,降低了建库成本,缩短了建库时间,操作更简便,结果更稳定可靠。本发明对于提高建库效率,减少人力成本有重要意义。