本发明公开用于检测BRAF V600基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其应用。本发明首先公开了用于检测BRAF V600基因突变的引物探针组合物,包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向引物V600M‑F和V600E‑F、SEQ ID NO.3所示的反向引物V600R和SEQ ID NO.4所示的检测探针V600P。进一步公开了包含上述引物探针组合物的试剂盒及其应用。利用本发明引物探针组合物对待测样本进行检测,灵敏度和特异性高,同时检测多种BRAF V600基因突变,可根据扩增曲线直接判断有无突变,无需计算ΔCt,简单直接。