本发明公开了一种基于Cas9基因的食线虫真菌基因编辑方法及其应用,涉及微生物基因工程和生物技术领域。本发明利用食线虫真菌的基因中如SEQ ID NO.1所示的外显子以及该外显子中分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示序列protospacer1、protospacer2,并设计SEQ ID NO.4~11所示的引物,先后构建三个载体并将三个载体引入食线虫真菌中。本发明提供了一种基于Cas9基因的食线虫真菌基因编辑方法,经本发明方法进行的基因编辑构建的菌株,可以自发产生捕器,大大提高了线虫抓捕效果。