本发明涉及一株稳定表达分泌型荧光素酶Gluc的GI型日本脑炎病毒重组毒及其构建方法与应用,利用同源重组技术,将JEV基因组cDNA分四个片段一次性克隆至低拷贝质粒pOK‑12中,并在病毒基因组全长的上游和下游分别添加T7启动子和丁型肝炎病毒的HDVR序列,从而获得GI型JEV的感染性cDNA克隆质粒pOK‑rGI;将一段Gluc‑T2A‑C34基因序列SEQ ID NO.2插入到病毒基因组中,即可获得携带有Gluc基因的重组病毒感染性cDNA克隆质粒pOK‑rGI‑Gluc。以线性化的感染性克隆质粒为模板,利用体外转录技术获得重组病毒的基因组RNA全长,并将RNA转染至BHK‑21细胞中,待细胞出现典型细胞病变时,即可获得表达Gluc蛋白的重组病毒rGI‑Gluc。该重组病毒具有遗传稳定型,感染细胞后能够分泌表达Gluc蛋白到细胞上清中,便于病毒的检测。