本发明公开了一种温度、酸度控制纤维素酶在巨大芽孢杆菌中表达的方法，属于基因工程领域。本发明方法包括如下步骤：将SEQ ID NO.1所示序列、SEQ ID NO.2所示序列通过限制性内切酶SmaI、XbaI及DNA连接酶分别连接到载体上构建同源重组质粒；将所构建的两个同源重组质粒转化巨大芽孢杆菌ATCC 14581，筛选同源重组成功的菌株。本发明以巨大芽孢杆菌为表达宿主，通过同源重组将纤维素外切酶基因和纤维素内切酶基因置于温度调控或酸调控元件下，实现了纤维素外切酶或内切酶的可控表达，从而能对黑曲霉纤维素酶进行定向复配，使纤维素外切酶、内切酶、葡糖苷酶达到合适的比例，提高纤维素催化效率。
本发明公开了一种增强芽孢杆菌碱性条件下纤维素外切酶表达量的方法，属于基因工程领域。本发明方法包括如下步骤：将由碱性启动子、SD序列、信号肽编码序列和纤维素外切酶编码基因组成的表达单元，通过同源重组整合到芽孢杆菌基因组中。本发明方法具体可为：将SEQ ID NO.5所示序列通过限制性内切酶SacI、XbaI及DNA连接酶连接到pHT01载体上构建同源重组载体；用所构建的同源重组载体转化地衣芽孢杆菌ATCC 9945a，筛选同源重组成功的菌株。通过本发明方法可以得到在碱性条件下高效表达纤维素外切酶的芽孢杆菌。本发明实现了纤维素外切酶在芽孢杆菌中的碱控表达。
本发明公开了一种在缩减基因组的枯草芽孢杆菌中表达黑曲霉葡糖苷酶的方法，属于基因工程领域。本发明方法包括如下步骤：将SEQ ID NO.1所示的DNA序列通过限制性内切酶SalI和DNA连接酶连接到载体上构建同源重组质粒；将所构建的同源重组质粒转化枯草芽孢杆菌KCTC1028，筛选同源重组成功的菌株。本发明在缩减基因组的枯草芽孢杆菌中表达葡糖苷酶，不但可以避免所缩减的蛋白对葡糖苷酶表达的干扰，使葡糖苷酶稳定表达，还使枯草芽孢杆菌的生长速率得到提高。
本发明公开了一种改变黑曲霉基因组局部结构提高纤维素酶表达量的方法，属于基因工程领域。本发明方法包括如下步骤：将两端有限制性内切酶识别位点且含有SEQ ID NO.1所示序列的同源重组片段通过相应限制性内切酶和DNA连接酶构建到载体上；将所构建的重组载体转化到黑曲霉中，筛选同源重组成功的黑曲霉菌株，同源重组成功的黑曲霉菌株的纤维素酶表达量得到提高。本发明把一段含有潮霉素B抗性表达单元盒和外加片段的序列通过同源重组的方式整合到黑曲霉基因组中改变整个基因组的长度，从而改变β‑葡萄糖苷酶表达单元在整个基因组中的位置，增强了β‑葡萄糖苷酶的表达效率。
本发明公开了一种双基因干扰提高黑曲霉纤维素酶酶活的方法，属于基因工程技术领域。本发明方法为通过RNAi降低黑曲霉植酸酶基因、葡糖苷酶基因的表达，具体包括如下步骤：将两端有限制性内切酶识别位点且含有SEQ ID NO.1所示序列的干扰片段通过相应限制性内切酶和DNA连接酶构建到pSilent‑1上；将所构建的重组载体转化到黑曲霉中，转化有重组载体的黑曲霉纤维素酶酶活得到提高。本发明通过RNAi干扰序列的合理设计，不仅显著降低植酸酶的表达，还适度降低葡糖苷酶的表达、增强纤维外切酶的表达，优化了纤维素酶酶系中三种酶的活性比例，提高了黑曲霉纤维素酶酶活。
