本发明涉及一种基于CRISPR‑Cas9技术的表达新型鹅星状病毒ORF2蛋白C端的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法,所述新型鹅星状病毒GD毒株ORF2蛋白C端,其序列如SEQ ID NO.1所示。重组血清4型禽腺病毒,其中使用新型鹅星状病毒GD毒株ORF2蛋白C端替换FAdV‑4的Fiber‑2基因的253位核苷酸到1440位核苷酸,FAdV‑4的Fiber‑2基因序列如SEQ ID NO.2所示。通过本发明,利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体插入新型鹅星状病毒ORF2蛋白C端,成功获得表达新型鹅星状病毒ORF2蛋白C端的重组血清4型禽腺病毒,为同时免疫防控血清4型禽腺病毒和新型鹅星状病毒提供了技术支撑与二联弱毒疫苗候选。