[发明专利]以绿荧光蛋白(GFP)为标记的肿瘤转移模型

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤发展的研究。具体地说，涉及用于研究脊椎动物系统中肿瘤转移的模型系统。

背景技术

一直以为，肿瘤组织的转移能力是恶性肿瘤威胁生命的主要原因。转移即在不同于原发肿瘤的部位长出了继发肿瘤。这样，虽然手术去除了原发肿瘤，但却不能阻止病情的发展。理解转移发生的机制对于开发出控制继发肿瘤生长的方法是至关重要的。为了理解转移机制，需要提供一种模型，它能够在大量的宿主细胞背景下鉴定出少量的肿瘤细胞，从而在实际病程发展中发现继发肿瘤栓和微转移。

已经有人用外部荧光标记的肿瘤细胞在体外证实了肿瘤转移过程中的外渗和最初的播种步骤。Khokha，R等，Cancer Metastasis Rev(1995)14：279-301；Koop，S.等，Cancer Rev(1995)55：2520-2523。而且，Margolis，L.B.等，In VitroCell Dev Biol.(1995)31：221-226显示外部荧光标记的肺肿瘤细胞在组织培养的宿主小鼠肺中的迁移。然而，在所有情况下由于外源荧光标记的限制而不能作长时间的观察。已知，用逆转录病毒来转移绿荧光蛋白基因(GFP)能在体外产生人癌症细胞(Levy，J.P.等，Nature Biotechnol(1996)14：610-614)和造血细胞(Grignani，F.等，Cancer Res(1998)58：14-19 & Cheng，L.等，Gene Therapy(1997)4：1013-1022)的稳定转染子。

曾经尝试提供以β-半乳糖苷酶基因为标记的模型(Lin，W.C.等，CancerRes.(1990)50：2808-2817；Lin，W.C.等，Invasion and Metastasis(1992)12：197-209)。但是，这一标记被证实不理想，因为不能使用新鲜或处理过的组织。本发明提供了一种标记，它能够显示活的新鲜组织中肿瘤的的入侵和微转移。而且，采用合适的对比介质，本发明方法可用于显示已形成和正在生长的肿瘤中的血管生成。本发明方法不仅可以用来作为肿瘤生长和转移的模型，而且利用逆转录病毒载体还可以用于获得肿瘤患者体内的临床信息。

本发明用绿荧光蛋白(GFP)作为标记。美国专利5,491,084揭示了该蛋白的异源表达，主要用于监测融合DNA的表达。该专利说明了GFP在大肠杆菌和C.elegans中的表达，还假设一般细胞都可以经修饰来表达GFP。根据该专利，这样的表达不仅是监测融合DNA表达的方法，而且还是监测蛋白质在细胞内定位的方法。

本发明提供转移模型方面的内容已在许多出版物中报道和描述过。Chrishima，T.等，Cancer Research(1997)57：2042-2047说明的是构建含有人源化绿荧光蛋白(GFP)基因和二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的二顺反子载体。该载体转染入CHO-K1细胞而得到克隆-38。克隆-38表现出稳定的GFP表达，在氨甲蝶呤(MTX)存在下维持。克隆-38细胞注射给小鼠获取肿瘤片段，然后通过外科正位移植(OSI)将片段移植到裸鼠的卵巢绒毛膜上。可以在该模型中跟踪转移。

Chishima，T.等Proc Natl Acad Sci USA(1997)94：11573-11576说明的是用来自Clontech的hGFP-S65T克隆的优化密码子转染Anip 973人肺腺癌制备克隆-26。克隆-26静脉注射给裸鼠，然后在组织培养物中跟踪生成的肿瘤。

Chishima，T.等Clin.Exp.Metastasis(1997)15：547-552和Chishima，T.等Anticancer Res(1997)17：2377-2384说明了用克隆-26进行的类似的工作，其中，所述细胞被皮下接种给裸鼠，导致生成肿瘤，然后将所得的肿瘤通过SOI移植到裸鼠的胸膜脏层。还在该模型中观察到了肿瘤转移。

Chishima，T.等In Vitro Cell Dev Biol.(1997)33：745-747说明的是克隆-26的组织培养和利用GFP发出的荧光显示其生长。

以上出版物均在此纳为参考。

此外，Chen，L.等，Gene Therapy(1997)4：1013-1022说明的是利用逆转录病毒启动子调控下的GFP基因来修饰造血干细胞。虽然，作者称用该系统转染人的干细胞只是有些困难，但是采用GFP的加强形式，可以获得令人满意的亮度。