[发明专利]一种重组低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明涉及重组菌技术领域，特别是涉及一种重组低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌及其应用。所述减毒炭疽芽孢杆菌包括降低和/或抑制炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白和MntA蛋白活性得到的菌。本发明通过Cre‑loxP系统结合自杀质粒介导的同源重组将炭疽芽孢杆菌A16R中编码Npr599蛋白和编码MntA蛋白的基因进行敲除，从而构建的减毒炭疽芽孢杆菌A16R‑NM菌株，所述的A16R‑NM菌株胞外蛋白酶活性与毒力较现有炭疽芽孢杆菌疫苗株A16R都有明显降低，能稳定表达保护性抗原，且能够形成芽孢，可用于制备稳定免疫的炭疽芽孢杆菌减毒活疫苗。

技术领域

本发明涉及重组菌技术领域，特别是涉及一种重组低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌及其应用。

背景技术

炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)是烈性传染病炭疽的病原菌，可感染人和动物。目前批准使用的炭疽疫苗主要分两大类，一类是中国和俄罗斯使用的减毒活芽孢疫苗，另一类是以美国的AVA疫苗和英国的AVP疫苗为代表的炭疽杆菌培养上清过滤后加铝盐佐剂吸附制备而成的蛋白疫苗。正常情况下，蛋白组分疫苗使用注射接种不便于群体免疫，且保存期不够理想，而活芽孢疫苗具有不必纯化抗原、易于大量生产、使用方便、保存期长等优点，在一定程度上符合炭疽疫苗开发研制的发展方向。

构建新型的减毒炭疽芽孢杆菌作为炭疽疫苗是研究新型炭疽杆菌疫苗的一种重要策略，如以色列的IIBR(Israel Institute forBiological Research)的研究人员通过缺失炭疽芽孢杆菌sterne株的htrA基因，构建了新的疫苗候选株，动物安全性实验显示，该菌株针对豚鼠的LD₅₀较sterne株提高了4个数量级以上，针对小鼠和兔子的LD₅₀也有不同程度的提高，表明其安全性较出发菌株有了极大的提高。动物免疫有效性实验显示，以1*10⁹剂量经皮下注射免疫豚鼠和兔子，仅通过一次免疫对100LD₅₀强毒株攻毒就能达到100％的保护，而且保护效果能够持续至少50周，可见减毒炭疽芽孢杆菌活芽孢疫苗具有良好的研究前景。

发明内容

为了实现上述目标，，本发明提供了一种重组低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌及其应用。本发明提供的减毒炭疽芽孢杆菌胞外蛋白酶活性与毒力较现有疫苗株A16R都有明显降低，能稳定表达保护性抗原，且能够形成芽孢，可用于制备稳定免疫的炭疽芽孢杆菌减毒活疫苗。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种重组低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌，所述减毒炭疽芽孢杆菌包括降低和/或抑制炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白和MntA蛋白活性得到的菌。

优选的，所述降低和/或抑制炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白和MntA蛋白活性包括沉默炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白编码基因和MntA蛋白编码基因的表达。

优选的，所述沉默炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白编码基因和MntA蛋白编码基因的表达包括采用Cre-loxP重组酶系统结合自杀质粒介导的同源重组的方式进行。

优选的，所述沉默炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白编码基因采用的同源重组的Npr599蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的第1～867位；

所述沉默炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白编码基因采用的同源重组的Npr599蛋白编码基因下游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的第2569～3395位；

所述沉默炭疽芽孢杆菌A16R中MntA蛋白编码基因采用的同源重组的MntA蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的第1～958位；