[发明专利]DNA片段靶向富集方法及其在基因组靶向测序中的应用

说明书

本发明公开一种DNA片段靶向富集方法，该方法包括根据靶标片段的DNA序列信息分析所述靶标片段上下游向导RNA，并合成所述向导RNA；获取样本DNA；通过cas9蛋白和所述向导RNA对所述样本DNA做体外cas9酶切反应，以从所述样本DNA上切割所述靶标片段；对通过体外cas9酶切反应切割的所述样本DNA进行琼脂糖凝胶电泳，切下与所述靶标片段条带大小对应的胶块；回收所述胶块中的DNA并进行测序。本发明提供的DNA片段靶向富集方法可适用度高，引入偏倚小。

技术领域

本发明涉及cas9-capture技术领域，具体涉及一种DNA片段靶向富集方法及其在基因组靶向测序中的应用。

背景技术

在分子实验中，需要大量的测序步骤。大部分情况下，科学研究或临床检测关注的都只是基因组上特定的一些基因，此时进行全基因组的测序，实际上绝大部分的测序数据是浪费的，因此DNA捕获技术对于高通量测序技术的广泛应用意义重大。

目前已有许多的技术方案着力于解决适合二代测序的DNA捕获，由于二代测序读长短，通过探针捕获、PCR捕获等方法可以较容易的将小片段的DNA捕获下来。然而，现有的捕获方法由于大多基于先将基因组DNA片段化，再进行捕获，不可避免的会带来捕获偏倚。而且，科学研究和临床检测中有相当一部分的基因用这些捕获方法并不合适，例如：长达2.3Mbp的DMD基因、含有polyQ的基因、DNA重复区域、copy number variation、微缺失/微重复综合征等。

因此有必要提供一种新型的DNA片段靶向富集方法，以解决上述技术问题。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种DNA片段靶向富集方法，以解决现有技术的DNA捕获方法存在捕获偏倚的技术问题。

为实现上述目的，本发明提出的DNA片段靶向富集方法，包括以下步骤：

根据靶标片段的DNA序列信息分析所述靶标片段上下游向导RNA，并合成所述向导RNA；

获取样本DNA；

通过cas9蛋白和所述向导RNA对所述样本DNA做体外cas9酶切反应，以从所述样本DNA上切割所述靶标片段；

对通过体外cas9酶切反应切割的所述样本DNA进行琼脂糖凝胶电泳，切下与所述靶标片段条带大小对应的胶块；

回收所述胶块中的DNA并进行测序。

优选地，所述获取样本DNA的步骤包括：

获取样本组织，加入DNA裂解液研磨后，加入蛋白酶K，密封并放入摇床，获得细胞裂解液；

在所述细胞裂解液中加入Tris饱和酚摇匀后，离心，获取第一上清液；

在所述第一上清液加入Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的混合液摇匀后，离心，获得第二上清液；

在所述第二上清液中加入氯仿和异戊醇的混合液后，离心，获得第三上清液；

在所述第三上清液中加入乙醇后，离心，弃上清，加入TE缓冲液，获得所述样本DNA。

优选地，所述Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的混合液中，Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1；

所述氯仿和异戊醇的混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1。

优选地，所述回收所述胶块中的DNA并进行测序的步骤包括：

回收所述胶块中的DNA，获得富集DNA片段；

在所述富集DNA片段中加入人工合成DNA片段，进行测序，所述人工合成DNA片段中带有尿嘧啶。