[发明专利]DNA片段靶向富集方法及其在基因组靶向测序中的应用

权利要求书

1.一种DNA片段靶向富集方法，其特征在于，包括以下步骤：

根据靶标片段的DNA序列信息分析所述靶标片段上下游向导RNA，并合成所述向导RNA；

获取样本DNA；

通过cas9蛋白和所述向导RNA对所述样本DNA做体外cas9酶切反应，以从所述样本DNA上切割所述靶标片段；

对通过体外cas9酶切反应切割的所述样本DNA进行琼脂糖凝胶电泳，切下与所述靶标片段条带大小对应的胶块；

回收所述胶块中的DNA并进行测序。

2.如权利要求1所述的DNA片段靶向富集方法，其特征在于，所述获取样本DNA的步骤包括：

获取样本组织，加入DNA裂解液研磨后，加入蛋白酶K，密封并放入摇床，获得细胞裂解液；

在所述细胞裂解液中加入Tris饱和酚摇匀后，离心，获取第一上清液；

在所述第一上清液加入Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的混合液摇匀后，离心，获得第二上清液；

在所述第二上清液中加入氯仿和异戊醇的混合液后，离心，获得第三上清液；

在所述第三上清液中加入乙醇后，离心，弃上清，加入TE缓冲液，获得所述样本DNA。

3.如权利要求2所述的DNA片段靶向富集方法，其特征在于，所述Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的混合液中，Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1；

所述氯仿和异戊醇的混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1。

4.如权利要求2所述的DNA片段靶向富集方法，其特征在于，所述回收所述胶块中的DNA并进行测序的步骤包括：

回收所述胶块中的DNA，获得富集DNA片段；

在所述富集DNA片段中加入人工合成DNA片段，进行测序，所述人工合成DNA片段中带有尿嘧啶。

5.如权利要求4所述的DNA片段靶向富集方法，其特征在于，所述在所述富集DNA片段中加入人工合成DNA片段，进行测序的步骤包括：

对所述富集DNA片段进行超声打断处理后，加入磁珠试剂并回收，再加入人工合成DNA片段，进行文库构建和测序。

6.如权利要求1所述的DNA片段靶向富集方法，其特征在于，所述DNA片段靶向富集方法还包括向导RNA及cas9蛋白切割效率的验证方法：

根据位于所述靶标片段上下游两端的所述向导RNA设计验证引物；

通过所述验证引物和所述样本DNA进行扩增，获得包括所述向导RNA的待验证片段；

通过所述cas9蛋白和所述向导RNA对所述待验证片段做体外cas9酶切反应，以切割所述待验证片段，将经过切割的所述待验证片段电泳与预设片段大小进行比较。

7.一种如前述的DNA片段靶向富集方法在基因组靶向测序，尤其是针对基因组结构变异，如拷贝数变异、微缺失微重复等的靶向测序中的应用。