[发明专利]用于多倍体枇杷果肉颜色基因分型的引物及其分型方法

权利要求书

1.一种多倍体枇杷果肉颜色的基因分型方法，包括如下步骤：

(1)、引物设计

针对EjPSY2A^d缺失片段设计EjPSY2A特异引物q2A，q2A引物序列为：

正向引物序列5’-3’：GGTGGATATGAATGGAATGATGGT；

反向引物序列5’-3’：GGCTAATGAGATCCGACGTTATTG；

针对EjPSY2A和EjPSY2A^d设计共同引物q2A/2A^d，q2A/2A^d引物序列为：

正向引物序列5’-3’：TTTTTGCTGACTGTTTATCTGCTCA；

反向引物序列5’-3’：AAACCACTTAAGACTCACGTGT；

(2)、内参

选择基因组内拷贝数恒定的DNA序列SSR标记CH03g12为内参，内参的引物序列为：

正向引物序列5-3’：GCGCTGAAAAAGGTCAGTTT；

反向引物序列5-3’：CAAGGATGCGCATGTATTTG；

(3)、q-PCR扩增

以二倍体为对照，利用特异性引物q2A和共同引物q2A/2A^d以及内参引物对多倍体的DNA进行q-PCR扩增，记录Ct值；所述q-PCR扩增中荧光值的检测使用荧光染料SYBR GreenⅠ法；

(4)基因型计算

根据目标基因的Ct值和内参Ct值，按照2^-ΔΔCt计算二倍体、多倍体材料中引物所在DNA序列的相对拷贝数；

EjPSY2A为红肉显性基因A，EjPSY2A^d为白肉隐性基因a；等位基因A和a的总相对拷贝数为a₃，以引物q2A/2A^d的Ct值计算；等位基因A的相对拷贝数为a₁，以引物q2A的Ct值计算；等位基因a的相对拷贝数为a₂＝a₃-a₁；

假定对照为杂合二倍体，杂合二倍体目标基因型的A/(A+a)值为b＝a₁/(a₁+a₂)，不同倍性材料，不同相对拷贝数的基因型如下：

四倍体：2×b，AAAA；3×b/2，AAAa；b，AAaa；b/2，Aaaa；0，aaaa；

三倍体：2×b，AAA；4×b/3，AAa；2×b/3，Aaa；0，aaa；

假定对照为纯合二倍体，纯合二倍体目标基因型的A/(A+a)值为b＝a₁/(a₁+a₂)，不同倍性材料，不同相对拷贝数的基因型如下：

四倍体：b，AAAA；3×b/4，AAAa；b/2，AAaa；b/4，Aaaa；0，aaaa；

三倍体：b，AAA；2×b/3，AAa；1×b/3，Aaa；0，aaa。