[发明专利]一种基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法

说明书

本发明公开了一种基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，它是通过设计一种DNA模板，当目标物镉离子存在的情况下，目标物拉近了链两端的距离，使得3’端和5’端互补配对，形成平末端；在T3 DNA连接酶的作用下，使该模板环化；再加入一段与环状模板互补配对的寡核苷酸链，作为后续扩增反应的引物；在加入phi 29 DNA聚合酶的作用下，开启滚环扩增反应，得到较长的一段核苷酸链条；在得到的产物中加入荧光染料SYBR Green I，使染料插入到DNA链条中，在517‑537nm的激发波长下，用紫外分光光度计进行检测样品，然后在487‑507nm的激发波下测得荧光强度；使用Real‑Time PCR方法对镉离子进行检测，验证本发明的方法的准确性。

技术领域

本发明涉及分析检测方法，具体为一种基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法。

背景技术

由于工业废水的排放，使得一些重金属元素排入河流、湖泊或者海洋中。重金属元素随着食物链进入生物体内，不能被生物降解掉，而是在生物体内逐渐积累，当达到一定量时，它会影响生物的正常生理活动，进而危害生物的健康。鉴于镉离子的有害影响，(EPA)美国环境保护局，设定了饮用水中的最大镉污染值为5ppb。所以实现镉离子的高灵敏性检测是一项至关重要的工作。常见的镉离子检测技术有原子吸收光谱法、原子荧光光谱法以及诱导耦合等离子体光谱法。尽管这些方法的选择性和准确性都很高，但是它们中大多数都需要复杂的样品预处理过程以及耗时的检测程序。因此，需要开发出一种具有高灵敏性、高特异性、简单、快速的镉离子检测方法。

滚环扩增技术因其扩增速度快、模板序列可设计、扩增分子量大以及保真度高等优点，被广泛应用于生物检测领域。这种等温酶扩增技术，它利用独特的DNA和RNA聚合酶，例如Phi29、Bst、Vent exo-DNA聚合酶以及T7 RNA聚合酶，最终可产生包含数十至数百个串联重复序列的单链DNA或者RNA。这种强大的扩增技术已成为生物医学研究和纳米生物技术中优良的工具。虽然这种扩增方法非常方便、高效，但是RCA系统在实际应用中由于产物量大，会引起非特异性非特异性结合。这是其在实际应用中的一个很大的挑战。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，设计目标物适配体序列的模板，该模板既作为识别元件又作为启动元件，激活信号扩增反应，然后通过滚环扩增技术将信号进行放大，提高了整个检测方法的灵敏度与特异性。

技术方案：本发明所述的基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，包括如下步骤：

(1)设计一种DNA模板，加入含有镉离子的样品溶液、T3连接酶混合液、T3 DNA连接酶反应缓冲液以及DEPC水，孵育；当目标物镉离子存在的情况下，目标物拉近了链两端的距离，使得3’端和5’端互补配对，形成平末端；在T3 DNA连接酶的作用下，该模板环化；

(2)再加入一段与上述环化模板互补配对的寡核苷酸链，作为后续扩增反应的引物；

(3)再加入phi 29DNA聚合酶，开启滚环扩增反应，得到较长的一段核苷酸链条；

(4)在步骤(3)得到的产物中加入荧光染料SYBR Green I，使染料插入到DNA链条中，在517-537nm的激发波长下，用紫外分光光度计检测样品中的镉离子，然后在487-507nm的激发波下测得荧光强度；

(5)使用Real-Time PCR方法对步骤(4)中样品的镉离子进行检测，验证本发明的方法的准确性。

所述的基于T3 DNA连接酶的镉离子检测方法，步骤(1)中所述的T3 DNA连接酶是在缓冲液1中，缓冲液1含有Tris-HCl、ATP、MgCl₂、DTT、PEG 6000；

步骤(2)扩增反应的缓冲液为缓冲液2，含有Tris-HCl、MgCl2、(NH4)₂SO₄、DTT；